Реорганизация ООО в форме присоединения к ООО в 2021 году

Каждое ООО, участвующее в присоединении должно провести общее собрание Участников.

С 01 октября 2014г. принятие общим собранием участников ООО Решения и состав Участников ООО, присутствовавших при его принятии, подтверждаются путем нотариального удостоверения, если иной способ не предусмотрен уставом ООО либо решением общего собрания участников общества, принятым участниками общества единогласно.

В ООО, состоящем из одного Участника, решения по вопросам, относящимся к компетенции общего собрания Участников ООО, принимаются единственным участником общества единолично и оформляются письменно. При этом нет надобности в соблюдении процедур созыва и проведения общего собрания Участников ООО.

В назначенный день проводится общее собрание Участников ООО, на котором принимается (или не принимается) решение о реорганизации в форме присоединения ООО к ООО.

Решение о реорганизации ООО в форме присоединения ООО к ООО принимается единогласно всеми Участниками ООО.

По итогу проведения собрания составляется Протокол, подписываемый Председательствующим и Секретарем, а также лицами, определенными Решением о реорганизации или Уставом, а в случае не указания в них, способа подтверждения принятого решения и состава Участников – нотариусом.

Не позднее чем в течение 10 дней после составления протокола общего собрания Участников ООО Руководитель (Генеральный директор) обязан направить копию Протокола общего собрания участников ООО всем Участникам ООО.

Затем, по истечении срока, указанного в Договоре о присоединении, на совместном общем собрании участников обществ, участвующих в присоединении, должно быть принято решение о внесении изменений в Устав основного ООО, а также при необходимости, по иным вопросам, в том числе об избрании органов (Генерального директора) основного ООО.

Порядок и сроки проведения такого общего собрания определяется также Договором о присоединении.

Решение по вопросам избрания исполнительных органов основного общества, принимается 3/4 от общего числа голосов, при этом количество голосов каждого участника определяется из расчета размера доли, которая будет принадлежать участнику в основном ООО. Решение по вопросу внесения изменений в Устав основного общества, принимается 2/3 от общего числа голосов.

Этапы реорганизации в форме присоединения

]]>

Подборка наиболее важных документов по запросу Этапы реорганизации в форме присоединения (нормативно–правовые акты, формы, статьи, консультации экспертов и многое другое).

Судебная практика: Этапы реорганизации в форме присоединения Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Постановление Двадцать первого арбитражного апелляционного суда от 29.04.2021 N 21АП-1454/2016 по делу N А83-5407/2010
Требование: Об отмене определения об отказе в процессуальном правопреемстве.
Решение: Определение оставлено без изменения.Исходя из изложенных выше норм права, по мнению суда апелляционной инстанции, наличие в ЕГРЮЛ записи о нахождении юридического лица в процессе реорганизации свидетельствует о том, что переход прав и обязанностей еще не завершен и на данном этапе факт правопреемства не состоялся. Юридическое лицо считается реорганизованным с момента внесения соответствующей записи в ЕГРЮЛ. При этом для каждой из форм реорганизации законодательство определяет наступление такого момента определенными событиями. В частности, реорганизация юридического лица в форме присоединения считается завершенной с момента внесения в ЕГРЮЛ записи о прекращении деятельности последнего из присоединенных юридических лиц. Только после наступления указанных событий, внесения в ЕГРЮЛ соответствующей записи правовые последствия, связанные с правопреемством, считаются наступившими.

Статьи, комментарии, ответы на вопросы: Этапы реорганизации в форме присоединения Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Статья: Правовые особенности процедуры реорганизации в форме выделения с одновременным присоединением в кредитных организациях
(Удальцова Н.Г.)
(«Банковское право», 2018, N 1)В настоящей статье подробно рассматриваются особенности и процедура (этапы и сроки) реорганизации в форме выделения с одновременным присоединением в рамках осуществляемой санации кредитных организаций. Положения данной статьи могут быть использованы в качестве основы плана-графика будущих реорганизационных действий кредитных организаций. Процедура смешанных реорганизаций в целом, а в банковском секторе, в частности, является дорогостоящей, очень масштабной, требующей кропотливой административной, юридической и организационной работы, в связи с чем она не получила повсеместного применения в России, в отличие от международного опыта.

Нормативные акты: Этапы реорганизации в форме присоединения Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
Банка России от 10.04.2014 N 06-52/2463
«О Кодексе корпоративного управления» Под реорганизацией с заинтересованностью в целях настоящего Кодекса понимается реорганизация в форме слияния или присоединения (либо включающая в себя слияние и (или) присоединение в качестве одного из ее этапов), при которой лицо (лица), контролирующее общество, одновременно является лицом (лицами), контролирующим хотя бы одно из иных юридических лиц, участвующих в реорганизации.

Этапы реорганизации в форме присоединения

Вопрос:

Этапы реорганизации с помощью присоединения самостоятельно действующей организации к другой организации. Пошаговые действия.

Ответ:

Определен примерный пошаговый алгоритм реорганизации юридического лица путем присоединения. Необходимо учитывать, что отдельные особенности процедуры зависят от конкретного вида юридического лица.

Обоснование:

Этап 1. Подготовка к принятию решения о присоединении, инвентаризация активов организации

Например, если одно ООО присоединяется к другому ООО, то общее собрание участников каждого общества, участвующего в реорганизации в форме присоединения, принимает решение о такой реорганизации, об утверждении договора о присоединении, а общее собрание участников присоединяемого общества также принимает решение об утверждении передаточного акта (пункт 2 статьи 53 Федерального закона от 08.

02.98 N 14-ФЗ «Об обществах с ограниченной ответственностью»). На данном этапе нужно предварительно подготовить проекты данных решений, договора о присоединении, передаточного акта.

Инвентаризация необходима во исполнение статьи 11 Федерального закона от 06.12.2011 N 402-ФЗ «О бухгалтерском учете», пункта 27 Положения по ведению бухгалтерского учета и бухгалтерской отчетности в Российской Федерации, утв. приказом Минфина России от 29.07.1998 N 34н.

Этап 2. Принятие участниками реорганизации решений о реорганизации в форме присоединения, об утверждении договора о присоединении (присоединяемой организацией — также об утверждении передаточного акта, пункт 2 статьи 59 Гражданского кодекса РФ)

Этап 3. Уведомление регистрирующего органа, кредиторов и публикация сведений в СМИ

В течение трех рабочих дней после даты принятия решения о реорганизации юридического лица оно обязано уведомить в письменной форме (по форме N Р12003, утв.  приказом ФНС России от 31.08.2020 N ЕД-7-14/617@) уполномоченный государственный орган, осуществляющий государственную регистрацию юридических лиц (ФНС России), о начале процедуры реорганизации с указанием формы реорганизации с приложением решения о реорганизации. Поскольку в реорганизации участвует два юридических лица, такое уведомление направляется юридическим лицом, последним принявшим решение о реорганизации или определенным решением о реорганизации (пункт 1 статьи 60 ГК РФ, пункт 1 статьи 13.1 Федерального закона от 08.08.2001 N 129-ФЗ «О государственной регистрации юридических лиц и индивидуальных предпринимателей»).

После даты отправки уведомления о начале процедуры реорганизации реорганизуемые юридические лица в течение пяти рабочих дней письменно уведомляют известных им кредиторов о начале реорганизации (пункт 1 статьи 60 ГК РФ, пункт 2 статьи 13.1 Закона N 129-ФЗ).

Также в течение трех рабочих дней с даты принятия решения о реорганизации необходимо разместить в ЕФРСФДЮЛ уведомление о реорганизации (подпункт «н. 6″ пункта 7 статьи 7.1 Закона N 129-ФЗ).

Когда запись о начале процедуры реорганизации уже внесена в ЕГРЮЛ, реорганизуемое юридическое лицо должно дважды, с периодичностью один раз в месяц, опубликовать в журнале «Вестник государственной регистрации» уведомление о реорганизации. Уведомление о реорганизации опубликовывается от имени всех участвующих в реорганизации юридических лиц юридическим лицом, последним принявшим решение о реорганизации либо определенным решением о реорганизации. В уведомлении о реорганизации указываются сведения о каждом участвующем в реорганизации, создаваемом или продолжающем деятельность в результате реорганизации юридическом лице, форма реорганизации, описание порядка и условий заявления кредиторами своих требований, иные сведения, предусмотренные законами для отдельных видов юридических лиц (пункт 1 статьи 60 ГК РФ, пункт 2 статьи 13.1 Закона N 129-ФЗ).

Этап 4. Проведение совместного собрания

Законами об отдельных видах юридических лиц может быть прямо предусмотрена необходимость проведения совместного общего собрания реорганизуемых участников (присоединяемого и того, к которому осуществляется присоединение).

Так, например, согласно пункту 3 статьи 53 Закона N 14-ФЗ совместное общее собрание участников обществ, участвующих в присоединении, вносит в устав общества, к которому осуществляется присоединение, изменения, предусмотренные договором о присоединении, а также при необходимости решает иные вопросы, в том числе вопросы об избрании органов общества, к которому осуществляется присоединение.

То, каким образом проводится собрание (сроки, порядок), определяется договором присоединения.

Этап 5. Подача документов для завершения процедуры реорганизации и совершение иных необходимых действий

До того как реорганизация будет завершена, необходимо решить кадровые вопросы посредством перевода работников или увольнения работников, отказавшихся от продолжения работы (статьи 72.1, 75, 77 ТК РФ).

В силу пункта 3 статьи 17 Закона N 129-ФЗ при реорганизации юридического лица в форме присоединения к нему другого юридического лица в регистрирующий орган по месту нахождения юридического лица, к которому осуществляется присоединение, представляются заявление о внесении записи о прекращении деятельности присоединенного юридического лица по форме, утвержденной уполномоченным Правительством Российской Федерации федеральным органом исполнительной власти, договор о присоединении и передаточный акт.

Тем самым, по истечении трех месяцев после внесения в ЕГРЮЛ записи о начале процедуры реорганизации в налоговый орган по месту регистрации фирмы, к которой присоединяется другая организация, подаются заявление о государственной регистрации в связи с завершением реорганизации юридического лица (юридических лиц) по форме Р12016 (утв. Приказом ФНС России N ЕД-7-14/617@), договор о присоединении и передаточный акт (пункт 4 статьи 57, пункт 1 статьи 60.1 ГК РФ, пункт 3 статьи 17 Закона N 129-ФЗ).

В случае изменения размера уставного капитала ООО подаются документы для государственной регистрации изменений в устав. В случае изменения сведений об участниках ООО, размере и номинальной стоимости их долей подаются документы для государственной регистрации изменений в ЕГРЮЛ (подпункты «д», «к» пункта 1 статьи 5, пункты 1, 2 стати 17 Закона N 129-ФЗ, пункт 2 статьи 12 Закона N 14-ФЗ).

Служба поддержки пользователей систем «Кодекс»/»Техэксперт»
     Эксперт Лисицкая Ольга Сергеевна

Реорганизация в форме присоединения в 2021 году

Реорганизация изначально задумывалась как возможность «модульного» использования юридических лиц. Имеется в виду, что юридические лица сходного типа (хозяйственные товарищества и общества) можно объединять друг с другом, можно объединить два вместе, и выделить третье, можно из нескольких сделать одно новое, и так далее. В этом, на наш взгляд, состоит «модульность».

Однако на практике чаще всего применяется процедура присоединения, и отнюдь не с той целью, которую закладывал в нее законодатель. А именно: присоединяемое юр. лицо прекращает свою деятельность и исключается из реестра, а все его обязательства и активы переходят к правопреемнику. В связи с такой особенностью процедура присоединения применяется с целью так называемой альтернативной ликвидации, когда ликвидация законная (в соответствии со ст. 61-64 ГК РФ) неприменима, например, из-за долгов, а точнее, из-за нежелания их выплачивать.

Используют ее на свой страх и риск, поскольку в последнее время ФНС обращает на подобное действие пристальное внимание, при этом разрабатывает и внедряет все новые механизмы противодействия такому типу ликвидации.

Итак, процедура востребованная, поэтому расскажем о ней подробнее. Она делится на этапы, общий срок занимает от 4 месяцев до полугода.

1. Принимается решение о начале процедуры реорганизации, и уведомление об этом регистрирующего органа. Само собой созывается общее собрание участников, причем решение принимается единогласно, в каждом из обществ участвующих в процедуре. Поскольку после 01.01.16 стало рискованно участвовать в реорганизации более чем двум юр. лицам (участие большего количества грозит проверкой на предмет внесения недостоверных сведений в ЕГРЮЛ и последующей приостановкой процедуры на срок до 1 месяца).

В регистрирующий орган подается:

• Уведомление о начале ликвидации, форма 12003 (заявитель — общество, обозначенное таковым в решении, или общество, принявшее решение о начале процедуры последним в связке. Лучше, конечно, обозначить заявителя).
• Решение или протокол (от каждого хоз. Общества, участвующего в процедуре).

Срок подачи — 3 рабочих дня с момента принятия решения о начале реорганизации (п. 5 ст. 5 ФЗ о регистрации юридических лиц и ИП).

Срок регистрации — 5 рабочих дней, дни подачи и получения не считаются.

Важно: В течение 5 рабочих дней после подачи документов необходимо уведомить о начале процедуры всех кредиторов (согласно п. 2 ст. 13.1 ФЗ о регистрации).

2. Как получили листы записи о начале процедуры — нужно подать документы на публикацию в Вестнике гос. регистрации. Сделать это придется два раза, с разницей в один месяц. Заявитель в Вестник — по аналогии с заявителем по Р12003, либо кто последний принял решение, либо кого назначили.

3. Спустя 30 дней с момента второй публикации, и не ранее трех месяцев с начала реорганизации, подается заявление о прекращении деятельности по форме Р16003. Если присоединение осуществляется в другой регион — подается в рег. орган того региона, куда «мигрирует» компания.

Итак, комплект документов (может варьироваться в зависимости от рег. Органа):

• Р16003 (подается всегда, от присоединяемой компании).
• Договор о присоединении (если участвует несколько компаний, лучше составить с каждой отдельный).
• Передаточный акт (могут и не спросить, уточняйте в конкретном рег. Органе).
• Решение/протокол о присоединении (о прекращении деятельности — вопрос не совсем в компетенции ОСУ, однако иногда требуют).

4. Если вы решили отменить уже запущенную процедуру реорганизации — подается в рег. орган по месту нахождения компании Р12003 и решение/протокол о прекращении процедуры.

2.7 / 5 ( 4 голоса )

Реорганизация путем присоединения — Consult Group

Присоединение — это форма реорганизации юридического лица, при которой присоединяемое юридическое лицо прекращает свою деятельность, а его права и обязанности переходят к юридическому лицу, к которому оно присоединяется. То есть одно или несколько юридических лиц, прекращая свое существование, входят в состав другой компании, которая в свою очередь принимает на себя все их обязательства.

Основным экономическим результатом этой юридической процедуры является объединение активов компаний, их сосредоточение в одних руках в целях улучшения рентабельности бизнеса, повышения конкурентоспособности на рынке и эффективности управления. Также присоединение может служить способом так называемой альтернативной ликвидации компании, часто используемой на практике как более простой и дешевый способ по сравнению с традиционной ликвидацией.

Отличие присоединения от слияния

По существу, реорганизация в форме присоединения очень похожа на реорганизацию в форме слияния. И там и там происходит фактическое объединение активов компаний. Разница между этими двумя формами состоит в юридических последствиях, а также в некоторых организационных моментах процедуры.

Так, при слиянии лица, участвующие в слиянии, прекращают свое существование, и на их базе возникает новое юридическое лицо, являющееся правопреемником. При присоединении же новое юридическое лицо не образуется. Здесь гражданские и налоговые права и обязанности присоединенного юридического лица переходят к присоединившему его юридическому лицу.

Наша компания оказывает квалифицированное юридическое и бухгалтерское сопровождение процедуры реорганизации путем присоединения, при котором мы гарантируем успешное прохождение всех ее этапов в полном соответствии с действующим законодательством.

Стадии реорганизации путем присоединения

Для того чтобы осуществить реорганизацию юридического лица путем присоединения необходимо пройти следующую процедуру:

• Принять решение о реорганизации путем присоединения. В обществе с ограниченной ответственностью данное решение принимается общим собранием участников. В некоторых случаях, предусмотренных законом, также требуется согласие антимонопольного органа.

При принятии решения о присоединении утверждаются:

• передаточный акт;
• договор о присоединении;

Затем проводится совместное общее собрание участников обществ, участвующих в присоединении, которое вносит в устав общества, к которому осуществляется присоединение, изменения, предусмотренные договором о присоединении, а также при необходимости решает иные вопросы, в том числе вопросы об избрании органов общества, к которому осуществляется присоединение.

В акционерном обществе решение о присоединении принимается общим собранием акционеров обществ, участвующих в присоединении, по представлению совета директоров общества, которое утверждает договор о присоединении, а также принимает решения по иным вопросам (в том числе решение о внесении изменений и дополнений в устав такого общества), если это предусмотрено договором о присоединении. Общее собрание акционеров присоединяемого общества принимает решение по вопросу о реорганизации в форме присоединения, включающее в себя утверждение договора о присоединении, передаточного акта.

• В течение 3 рабочих дней после даты принятия решения о реорганизации нужно в письменной форме уведомить регистрирующий орган о начале процедуры реорганизации с приложением решения о реорганизации.
• Дважды не реже одного раза в месяц опубликовать в СМИ («Вестник государственной регистрации») информацию о начале реорганизации.
• Сформировать пакет документов и представить их в регистрирующий орган вместе с заявлением о и заявлением о государственной регистрации юридического лица, создаваемого путем реорганизации №Р12001.

При реорганизации юридического лица в форме присоединения к нему другого юридического лица первое из них считается реорганизованным с момента внесения в единый государственный реестр юридических лиц записи о прекращении деятельности присоединенного юридического лица.

•  На 6-й рабочий день лично или через представителя по нотариально удостоверенной доверенности получить документы о государственной регистрации. А именно:
  • свидетельство о государственной регистрации;
  • один экземпляр учредительного документа с отметкой регистрирующего органа;
  • лист записи ЕГРЮЛ.
• Осуществить необходимые действия после регистрации присоединения. Здесь требуется:
  • уничтожить печать ликвидированных юридических лиц;
  • переоформить права на недвижимое и движимое имущество;
  • переоформить существующие патенты и товарные знаки.

Обращаясь к нам за юридической помощью, Вы можете положиться на обширный опыт, знания и навыки наших специалистов, которые помогут Вам правильно составить и заполнить все необходимые документы, провести собрания учредителей, подать заявления в налоговые органы и провести другие мероприятия при реорганизации путем присоединения вовремя и без проволочек. Мы гарантируем качество услуг, выполнение их в положенный срок, индивидуальный поход и внимательное отношение к каждому клиенту!

Реорганизация ООО в форме присоединения

На данной странице Вы найдёте всю необходимую полезную информацию об услуге Реорганизация ООО в форме присоединения, если Вас интересует дополнительная информация по данной услуге, Вы можете позвонить к нам в офис по телефону: 8 (495) 782 69 60

Стоимость услуги по Реорганизации фирмы в форме присоединения (ООО,ЗАО)

• Присоединение ООО, ЗАО  —  от 55 000 руб.

Дополнительно оплачивается:

• Нотариальные расходы и государственные пошлины по Присоединению ООО, ЗАО включены в стоимость услуги.

Срок Реорганизации в форме присоединения ООО составляет 4 месяца.

В форме присоединения можно реорганизовать коммерческую организацию любой организационно правовой формы (ООО,ЗАО,ОАО).

---

Тариф «Эконом»	Тариф «Базовый»	Тариф «Всё включено»	Тариф «Всё включено» + бухгалтерия
Что включено: только подготовка пакета документов; отправим вам на почту или передадим на бумаге у нас в офисе. Что не включено: подготовка документов для публикации сообщения в журнале «Вестник государственной регистрации». Срок: 1-2 дня Стоимость: 7 000р. за этап Всего 2 этапа: уведомление о начале процедуры реорганизации; государственная регистрация в связи с завершением реорганизации.	Что включено: подготовка пакета документов; всё расскажем и покажем, куда ехать и что подавать; подготовка документов для публикации сообщения в журнале «Вестник государственной регистрации». Срок: 2-3 дня Стоимость: 10 000р. за этап Всего 3 этапа: уведомление о начале процедуры реорганизации; публикация сообщения в журнале «Вестник государственной регистрации»; государственная регистрация в связи с завершением реорганизации.	Что включено: консультации; подготовка пакета документов на всех этапах; подготовка документов для публикации сообщения в журнале «Вестник государственной регистрации»; сопровождение вас у нашего нотариуса без очереди; подача и получение документов; формирование квитанции для оплаты госпошлины; курьерские услуги, вам не нужно приезжать к нам в офис. Срок: 4-6 месяцев Стоимость: 50 000р.	Что включено: консультации; подготовка пакета документов на всех этапах; подготовка документов для публикации сообщения в журнале «Вестник государственной регистрации»; сопровождение вас у нашего нотариуса без очереди; подача и получение документов; формирование квитанции для оплаты госпошлины; курьерские услуги, вам не нужно приезжать к нам в офис; бухгалтерские услуги по составлению передаточного акта Срок: 4-6 месяцев Стоимость: 70 000р.

---

Механизм Присоединения фирмы (ООО,ЗАО):

Начала процедуры Присоединения ООО: В МИФНС сдается комплект документов о начале реорганизации в форме присоединения фирмы. В течении шести рабочих дней проводятся регистрационные действия, после чего заявителем получается свидетельство о начале процедуры реорганизации в форме присоединения ООО и выписка из ЕГРЮЛ подтверждающая внесение соответствующих изменений.

Публикация №1: После окончания регистрации первого этапа реорганизации в форме присоединения фирмы в официальное печатное издание «Вестник государственной регистрации» подается информация о начале процедуры реорганизации в форме присоединения ООО, информация о данной регистрационной процедуре публикуется в официальном издании сроком на один месяц.

Публикация №2: В соответствии с действующим законодательством в печатном издании «Вестник государственной регистрации» проводится вторая, повторная публикация информации о реорганизации в форме присоединения ООО. Срок публикации составляет ещё один месяц.

Регистрация Присоединения фирмы: Четвертым и окончательным этапом процедуры реорганизации в форме Присоединения ООО является подача комплекта документов в регистрирующий орган МИФНС. После сдачи комплекта документов заявитель получает расписку с датой получения. Завершающим этапом регистрационных действий является получение в МИФНС свидетельства о прекращении деятельности юридического лица и Выписка из ЕГРЮЛ с записью о прекращении деятельности. С этого момента организация считается реорганизованной в форме присоединения фирмы.

---

Сведения необходимые для реорганизации фирмы:

• Свидетельство о государственной регистрации фирмы
• Свидетельство о постановке на учет в налоговом органе
• Выписка ЕГРЮЛ (срок давности не позднее 30 дней)
• Устав
• Копия паспорта руководителя

---

Дополнительно Вы можете заказать у нас:

• Предоставление юридического адреса от собственника с рабочим местом (Наша компания готова предложить Вам крупнейшую базу юридических адресов от собственников не жилых помещений г. Москвы и Московской области)
• Регистрация новой фирмы
• Ликвидация ООО

---

Важно Перерегистрация ООО!

В соответствии с ФЗ №312 все зарегистрированные до 01.07.09 года ООО должны пройти обязательную перерегистрацию. Если Ваша компания проходит процедуру реорганизации фирмы в форме Присоединения и при этом не была проведена обязательная перерегистрация ООО, то при данном виде регистрации необходимо внесении изменений в учредительные документы. При проведении регистрационных действий связанных с Реорганизацией ООО есть возможность одновременно провести перерегистрацию общества с ограниченной ответственностью.

---

Дополнительная информация:

Реорганизация Общества с ограниченной ответственностью в форме Присоединения является на сегодняшний день самым распространенным и популярным способом реорганизации фирмы. Такая популярность данного способа реорганизации среди столичных предпринимателей в первую очередь обусловлена достаточно быстрыми сроками проведения регистрационных действий. Срок реорганизации в форме Присоединения ООО составляет четыре месяца. За этот период проводится четыре стадии реорганизации общества с ограниченной ответственностью в форме присоединения. Так стадиями присоединения ООО являются начало процедуры реорганизации, две публикации в печатном издании «Вестник Государственной Регистрации», окончание процедуры реорганизации в форме присоединения ООО.

В печатном издании «Вестник Государственной Регистрации» публикуется информация о реорганизации в форме присоединения ООО. Так в издании отображается информация о том какая компания к какой присоединяется. Указываются реквизиты данных организаций и другая информация. В соответствии с действующим законодательством требуются две публикации информации о присоединении фирмы в печатном издании «Вестник Государственной Регистрации». Каждая публикация длится в течении одного месяца. В форме присоединения можно реорганизовать коммерческую организацию любой организационно правовой формы.

Присоединением общества с ограниченной ответственностью является прекращение деятельности одного юридического лица либо нескольких юридических лиц. При присоединении фирмы полный объем прав и обязанностей переходит другому юридическому лицу. При этом новое юридическое лицо, которому переходят права и обязанности регистрируется до начала процедуры реорганизации в форме присоединения. Общий срок присоединения фирмы составляет 4 месяца.

Реорганизация в форме Присоединения ООО является достаточно сложной процедурой требующей высокого профессионализма юристов проводящих данные регистрационные действия. Специалисты юридической фирмы Флекс Консалтинг обладают необходимым уровнем квалификации и опыта, партнерских контактов в регионах Российской Федерации для проведения реорганизации в форме присоединения ООО. При этом наиболее актуальным способом реорганизации фирмы у наших клиентов является реорганизация в форме присоединения ООО.

Как учитывать убытки, если в организации проходит процедура реорганизации в форме присоединения?

В нашей организации происходит реорганизация в форме присоединения к другому предприятию. Подскажите, пожалуйста, порядок присоединения, его этапы. В налоговой инспекции нам выдали свидетельство о том, что организация находится в стадии реорганизации. Какие дальнейшие действия нужно предпринять? Когда составлять акт передачи? Также в 1 квартале 2013 года был получен убыток. Как это учесть при реорганизации?

Порядок реорганизации

Процедура реорганизации в форме присоединения включает следующие этапы:

• принятие решения о реорганизации;
• утверждение договора о присоединении и передаточного акта;
• получение согласия на присоединение в федеральном антимонопольном органе, если это требуется;
• направление уведомления в налоговый орган о начале процедуры реорганизации;
• письменное уведомление кредиторов, а также публикация сообщения о реорганизации в органе печати;
• государственная регистрация связанных с реорганизацией изменений и дополнений в учредительные документы общества, к которому осуществляется присоединение, а также внесение в ЕГРЮЛ записи о прекращении деятельности присоединяемой организации.

В соответствии с пунктом 2 статьи 59 ГК РФ передаточный акт утверждается учредителями (участниками) юридического лица, принявшими решение о реорганизации обществ. Показатели передаточного акта подтверждаются результатами проведенной инвентаризации имущества, которая является условием достоверности отражения в учете переходящего к правопреемнику имущества, имущественных прав и финансовых обязательств и носит обязательный характер.

В соответствии с пунктом 2 статьи 58 ГК РФ передаточный акт является документом, определяющим переход прав и обязанностей от присоединяемого общества к правопреемнику. Передаточный акт должен содержать положение о правопреемстве по всем обязательствам реорганизованного юридического лица в отношении всех его кредиторов и должников, включая и обязательства, оспариваемые сторонами.

Составление передаточного акта рекомендуется приурочивать к концу отчетного периода (года) или дате промежуточной бухгалтерской отчетности (квартала, месяца), являющейся основанием для характеристики и оценки передаваемого имущества и обязательств реорганизуемой организацией (п. 6 Методических указаний по формированию бухгалтерской отчетности при осуществлении реорганизации организаций, утв. приказом Минфина России от 20.05.2003 № 44н).

Учет убытков, полученных присоединяемой организацией

Одинаковые налоговые режимы у присоединяемой и присоединяющей организации

Если правопреемник и присоединяемая организация применяют одинаковые режимы налогообложения, то правопреемник признает убытки, образовавшиеся у присоединяемой организации, в качестве расходов, уменьшающих налоговую базу:

• согласно пункту 1 статьи 283 НК РФ налогоплательщики, понесшие убыток (убытки), исчисленный в соответствии с главой 25 НК РФ в предыдущем налоговом периоде или в предыдущих налоговых периодах, вправе уменьшить налоговую базу текущего налогового периода на всю сумму полученного ими убытка или на часть этой суммы (перенести убыток на будущее). Таким образом, при исчислении налоговой базы по налогу на прибыль организаций возможно учесть только тот убыток, который сформирован по правилам главы 25 НК РФ;
• согласно пункту 7 статьи 346.18 НК РФ налогоплательщики, применяющие УСН и использующие в качестве объекта налогообложения доходы, уменьшенные на величину расходов, вправе уменьшить исчисленную по итогам налогового периода налоговую базу на сумму убытка, полученного по итогам предыдущих налоговых периодов, в которых налогоплательщик применял упрощенную систему налогообложения и использовал в качестве объекта налогообложения доходы, уменьшенные на величину расходов.

Следовательно, организация-правопреемник, применяющая такой же режим налогообложения, как и присоединенная организация, может учесть в составе расходов убыток, который был понесен присоединенной к ней компанией. Такой вывод подтверждается письмом УФНС России по г.Москве от 27.04.2009 № 16-15/041113.

Разные налоговые режимы у присоединяемой и присоединяющей организации

В соответствии с пунктом 7 статьи 346.18 НК РФ убыток, полученный налогоплательщиком при применении иных режимов налогообложения, не принимается при переходе на упрощенную систему налогообложения. Убыток, полученный налогоплательщиком при применении упрощенной системы налогообложения, не принимается при переходе на иные режимы налогообложения.

Организация-правопреемник, применяющая общий режим налогообложения, не вправе уменьшить базу по налогу на прибыль на убытки присоединенной компании, применявшей до присоединения УСН (письмо Минфина РФ от 25.09.2009 № 03-03-06/1/617).

Узнать о том, правомерно ли увольнять сотрудников при реорганизации, можно в «Справочнике кадровика» раздела «Кадры и оплата труда» на ИТС .

Пятиэтапный процесс реорганизации после слияния

Реорганизации могут быть полезным инструментом управления для поиска новых ценностей и часто необходимы в рамках интеграции слияний или поглощений. Правильная реорганизация этого типа позволяет беспрепятственно объединять бизнес-единицы объединяющихся компаний, стандартизировать и оптимизировать корпоративную деятельность, согласовывать людей для достижения желаемых результатов и быстро обеспечивать синергию интеграции.

Но, согласно исследованию McKinsey, только 16% реорганизаций слияний полностью достигают своих целей в запланированные сроки, 41% занимают больше времени, чем ожидалось, а в 10% случаев реорганизация фактически наносит ущерб вновь созданной организации. Распространенными ошибками являются отсутствие культурного взаимопонимания между интегрирующими сторонами, плохое руководство интеграцией и сосредоточение внимания на неправильном наборе действий или неправильных целях.

Чтобы помочь максимизировать ценность и свести к минимуму неприятности реорганизации, мы разработали пятиэтапный процесс их выполнения.Эти шаги применимы ко всем реорганизациям в целом, и данные нашего опроса показывают, что компании, использующие этот процесс, в три раза чаще других достигают желаемых результатов. В этой статье мы конкретно покажем, как они применяются к реорганизации, проводимой на основе слияний и поглощений. В эффективных ситуациях слияний и поглощений шаги 1-3 должны быть подробно рассмотрены до закрытия сделки, а шаги 4 и 5 выполняются после закрытия.

Шаг 1. Составьте отчет о прибылях и убытках

В рамках вашего плана слияний и поглощений вы должны учитывать выгоды, затраты и сроки реорганизации.Помните, что затраты — это не только затраты на сотрудников, консультантов, юристов и банкиров: они также включают человеческие затраты на изменения и нарушения, которые они могут нанести вовлеченным предприятиям. Производительность бизнеса может пострадать, и ключевые сотрудники могут начать искать возможности в другом месте. Может показаться здравым смыслом взвесить эти затраты и выгоды вместе со слиянием, но, согласно исследованию McKinsey, только 15% руководителей устанавливают подробные бизнес-цели для своих реорганизаций.

В случае международной коммунальной компании рассмотрение практических вопросов реорганизации позволило приобретающей компании сконцентрироваться на стратегическом уровне.В начале процесса сделки была признана проблема реорганизации европейского бизнеса (из-за нормативных и юридических соображений), и слияние этой части бизнеса было отложено на 12 месяцев. Компания осознала, что это отсрочит полное влияние слияния на год или два. В то же время это осознание позволило им сосредоточиться на работе по реорганизации головных офисов и добиться роста.

Шаг 2: Определите текущие слабые и сильные стороны

В ситуации слияний и поглощений истинные сильные стороны каждой организации могут быть скрыты или плохо поняты, и даже могут быть повреждены безрассудным стремлением добиться немедленной синергии затрат.

Может быть трудно понять сильные и слабые стороны до закрытия сделки. Тем не менее, вы можете получить некоторое представление о результатах комплексной проверки, собеседованиях с бывшими сотрудниками компании (в том числе в вашей собственной организации) или в Интернете — будь то собственные публикации компании или сайты, такие как LinkedIn, которые позволяют вам профилировать отдельные менеджеры. То, как вы подойдете к этому шагу, также зависит от того, будет ли это поглощение (где позиция по умолчанию заключается в том, что приобретенная организация будет в значительной степени поглощена) или настоящее слияние, при котором вы можете искать подход «наилучшего из обоих» от в компаниях с точки зрения организации и персонала.

В случае слияния двух сервисных компаний перед закрытием запрашивалось внутреннее и внешнее представление о каждом бизнесе, и составлялся список приоритетных областей, в которых участвовали люди, процессы и структурные аспекты. После закрытия менеджеры обоих предприятий поделились своими взглядами в ходе интервью и электронных сообщений. Эти наблюдения были сопоставлены с исходными гипотезами, и список основных направлений был обновлен. Это подчеркнуло сильные стороны в отзывчивости клиентов, но общий провал в создании и отправке групп технического обслуживания.Решение этой проблемы в новой организации помогло оптимизировать процесс распределения ресурсов, что привело к снижению затрат и повышению уровня обслуживания клиентов.

Шаг 3. Рассмотрите несколько вариантов

Распространенная ошибка — сосредоточиться на , как выглядит организация, (например, ее структура отчетности) и забыть о , как она работает (управление и бизнес-процессы и системы; числа, возможности, образ мышления и поведение ее сотрудников). люди).По нашему опыту, последнее обычно более важно.

В контексте слияний и поглощений еще до закрытия сделки можно разработать убедительную гипотезу о том, как будет выглядеть новая организационная структура (по определению вам нужно будет выбрать одну структуру, объединяющую две компании). Обычно основное внимание уделяется людям: как количеству, так и необходимому (поскольку часть синергии явно будет исходить от эффективности персонала), так и общей культуре, которую необходимо создать в новой компании.Однако, как отмечалось выше, важно не забывать о процессах: компании обычно выполняют свои процессы (принимают ли они решение по стратегии, запускают продукт или процесс или выполняют повседневные операции) и распределяют задачи по каждому процессу. очень разными способами. Путаница вокруг этих процессов и распределения деятельности после слияния — частая проблема.

При разработке организационных решений мы считаем, что явный выбор из множества вариантов является лучшим подходом.Ни одно решение не будет идеально соответствовать всем будущим возможностям, и каждое решение будет иметь свои недостатки: только взвесив альтернативы, вы увидите, что вы можете получить, а что потеряете. В ситуации слияния и поглощения две сливающиеся компании представят два разных способа организации, поэтому они, а также комбинация лучшего из обоих, предоставляют три очевидных варианта.

Этот подход использовался при объединении двух горнодобывающих компаний. Компания-покупатель хотела сохранить свой операционный подход и воспроизвести его в рамках недавно приобретенного бизнеса.Это помогло получить информацию при первоначальном обсуждении дизайна и сузить круг выбора, открытый для новой команды руководства. Чтобы протестировать более подробные варианты, вновь назначенной группе руководителей были представлены альтернативные решения для технологической организации, инвестиционных процессов и делегаций по безопасности. Они предусмотрели себя в каждом из вариантов и предоставили обратную связь: «это не та роль, которую я хотел бы выполнять», «как мы будем согласовывать решения с учетом конкурирующих интересов этих ролей» и «это немного запутанный процесс.Это исключило непривлекательные варианты и помогло им прийти к консенсусу по организационной структуре.

Шаг 4. Правильное подключение сантехники и электропроводки

После шага 3 большинство руководителей отступают, доверяя своим командам разобраться в деталях новой организации и плана перехода. Внешние консультанты обычно тоже отключаются на этом этапе. Тем не менее, мы неоднократно обнаруживали — и опрос McKinsey в 2014 году подтвердил, — что шаг 4 — самая сложная часть реорганизации.

В ситуациях слияний и поглощений это еще больше усложняется тем фактом, что подробная информация становится доступной только относительно поздно. Перед закрытием сделки возможна некоторая планировка и даже довольно детальный дизайн. Однако, когда сделка будет заключена, вы должны быстро вернуться к гипотезам из предыдущих шагов — предположениям о синергии (шаг 1), пониманию сильных и слабых сторон приобретенной компании (шаг 2) и концептуальному дизайну (шаг 3). ) — чтобы подтвердить их надежность и, при необходимости, улучшить их.

В ходе недавнего слияния компаний нефтегазовой отрасли была сформирована большая группа интеграции, в состав которой вошли представители обеих организаций и из разных сфер бизнеса, для координации усилий по интеграции. Руководители по переходному этапу были назначены для помощи в управлении повседневной интеграционной деятельностью в каждой сфере бизнеса; Некоторым руководителям был предоставлен ранний контроль за областями, которые они будут нести ответственность за ввод в эксплуатацию новой организационной структуры. Каждой части интеграционной группы была дана цель взаимодействия, ожидания в отношении согласования процессов и культуры, а также четкая ответственность за интеграцию людей в рамках их определенных границ.Руководители этих групп интеграции подчинялись непосредственно генеральному директору и совету директоров. Это позволило командам быстро обострить проблемы, которые они обнаружили, например необходимость добиться еще более значительного снижения затрат в более жесткой внешней среде. Это побудило компанию внести некоторые изменения в конструкцию и добиться дополнительных синергетических преимуществ, извлекая уроки из более экономичного подхода, используемого в приобретенном бизнесе.

Шаг 5. Запуск, обучение и исправление курса

Независимо от того, сколько мыслей и подготовки вы вложили в реорганизацию, нереально ожидать, что она с самого начала будет работать идеально.Так обстоит дело со всеми реорганизациями, но это применимо еще больше, когда две организации с совершенно разными культурами терпят крах вместе. Это не означает, что вам нужно делать переворот на 180 градусов в дизайне, как только вы столкнетесь с проблемой. Но вам нужно побудить всех указать на зарождающиеся проблемы новой организации, открыто обсудить решения и как можно скорее внедрить соответствующие исправления в соответствии с логикой ваших первоначальных планов. После интеграции слияния и поглощения также важна формальная оценка.Мы считаем, что лучше всего это делать после одного-двух циклов финансовой отчетности, чтобы вы могли оценить, где финансовые показатели соответствуют ожиданиям, а какие нет, и связать это с организационной структурой. И если вы планируете делать больше слияний и поглощений, получение результатов вашего опыта для следующего раунда имеет решающее значение.

Возвращаясь к нашему примеру с полезностью, организация была обязана сообщать о прогрессе во внедрении новой организации в рамках своего обычного цикла результатов и отвечала на постоянно растущий круг вопросов от советов предприятий относительно того, как изменения будут реализованы в Европе.Руководящая группа оценила прогресс интеграции, основываясь на этой обратной связи, и рассмотрела, где можно сделать дополнительные уточнения. Выявлены проблемы в коммерческом и торговом бизнесе и предложены новые решения. Кроме того, была проведена дальнейшая консолидация некоторых вспомогательных операций (в основном кадровых), что дало дополнительную экономию средств.

Если вы подумываете о реорганизации на основе слияний и поглощений, вы обязаны перед своими акционерами и сотрудниками следовать строгому процессу, а не разгонять его, как это делают многие лидеры.Вы будете принимать более обоснованные решения, поддерживать вовлеченность и заинтересованность своих сотрудников и получать больше прибыли.

Реорганизация ООО в форме присоединения в г. Минске

Реорганизация ООО в форме присоединения к является одной из форм универсального правопреемства для юридических лиц, предусмотренных гражданским законодательством Республики Беларусь.

Реорганизация как альтернативный метод ликвидации.

Популярность реорганизации в форме присоединения среди хозяйствующих субъектов в первую очередь связана с тем, что в некоторых ситуациях это очень хорошая альтернатива ликвидации.Например, если группа компаний зарегистрировала бизнес-компанию, и тогда стало ясно, что спешить не стоит.

Ликвидация такой компании в общем порядке займет до шести месяцев, а то и больше, потребует назначения ликвидатора и определенных затрат. При этом присоединение можно осуществить в гораздо более короткие сроки. Однако недостаточно просто зарегистрировать факт включения в Единый государственный реестр юридических лиц и индивидуальных предпринимателей , это нужно сделать более корректно.

Порядок регистрации присоединения.

Присоединение к кредиторам и уведомление их.

Прежде всего, присоединенное юридическое лицо должно уведомить своих кредиторов о решении присоединиться. При этом необходимо уведомлять не только кредиторов, срок исполнения обязательств которых наступил. Но и кредиторы, срок исполнения обязательств у которых наступит в ближайшее время. Уведомление должно быть отправлено заказным письмом на юридический адрес кредитора.Важно помнить, что кредиторы не могут запретить присоединение, независимо от того, насколько они этого хотят. Они могут только требовать досрочного исполнения обязательств и возмещения убытков, возникших в связи с этим.

Решение о присоединении.

Решение о реорганизации принимается общими собраниями участников хозяйственных обществ, участвующих в реорганизации. Решение должно быть единодушным независимо от наличия кворума. Детали условий присоединения прописаны в соглашении о присоединении.Хотя реорганизация ООО в форме присоединения не сопровождается фрагментацией имущества участвующих в ней субъектов, пренебрегать подготовкой договора о присоединении, а также передаточного акта не стоит. Ведь важно понимать, какие обязательства были переданы (были) на момент возникновения правопреемства.

Увольнение или перевод сотрудников.

Следует помнить и о необходимости обозначать статус сотрудников дочерней организации.Они должны быть либо уволены с выплатой компенсации, либо переведены с их согласия новому работодателю. Директор дочерней компании неизбежно подлежит увольнению или переводу к новому работодателю на новую должность. Договор с менеджером, индивидуальным предпринимателем или управляющей организацией должен быть расторгнут.

Выход.

При наличии значительного количества сотрудников и активов не следует спешить с завершением реорганизации путем регистрации изменений и дополнений в устав «Остающийся» субъект.Ведь ошибки на подготовительном этапе могут повлечь за собой не только штрафы в виде административной ответственности, но и признание несостоявшейся реорганизации, что повлечет за собой негативные последствия, которые могут выражаться не только в недостижении цели. , но и нести большие убытки.

Контактные данные ответственного лица: Скобей Андрей Николаевич, лицензиат-юрист, с ним можно связаться по телефону (+ 37529 1102388) или по электронной почте (info @ legaltime.к).

SEC.gov | Превышен порог скорости запросов

Чтобы обеспечить равный доступ для всех пользователей, SEC оставляет за собой право ограничивать запросы, исходящие от необъявленных автоматизированных инструментов. Ваш запрос был идентифицирован как часть сети автоматизированных инструментов за пределами допустимой политики и будет обрабатываться до тех пор, пока не будут приняты меры по объявлению вашего трафика.

Пожалуйста, объявите свой трафик, обновив свой пользовательский агент, чтобы включить в него информацию о компании.

Для лучших практик по эффективной загрузке информации из SEC.gov, включая последние документы EDGAR, посетите sec.gov/developer. Вы также можете подписаться на рассылку обновлений по электронной почте о программе открытых данных SEC, включая передовые методы, которые делают загрузку данных более эффективной, и улучшения SEC.gov, которые могут повлиять на процессы загрузки по сценариям. Для получения дополнительной информации обращайтесь по адресу [email protected].

Для получения дополнительной информации см. Политику конфиденциальности и безопасности веб-сайта SEC. Благодарим вас за интерес к Комиссии по ценным бумагам и биржам США.

Идентификатор ссылки: 0.67fd733e.1632478901.60620776

Дополнительная информация

Политика безопасности в Интернете

Используя этот сайт, вы соглашаетесь на мониторинг и аудит безопасности. В целях безопасности и обеспечения того, чтобы общедоступная услуга оставалась доступной для пользователей, эта правительственная компьютерная система использует программы для мониторинга сетевого трафика для выявления несанкционированных попыток загрузки или изменения информации или иного причинения ущерба, включая попытки отказать пользователям в обслуживании.

Несанкционированные попытки загрузить информацию и / или изменить информацию в любой части этого сайта строго запрещены и подлежат судебному преследованию в соответствии с Законом о компьютерном мошенничестве и злоупотреблениях 1986 года и Законом о защите национальной информационной инфраструктуры 1996 года (см. Раздел 18 U.S.C. §§ 1001 и 1030).

Чтобы обеспечить хорошую работу нашего веб-сайта для всех пользователей, SEC отслеживает частоту запросов на контент SEC.gov, чтобы гарантировать, что автоматический поиск не влияет на возможность доступа других лиц к контенту SEC.gov. Мы оставляем за собой право блокировать IP-адреса, которые отправляют чрезмерное количество запросов. Текущие правила ограничивают пользователей до 10 запросов в секунду, независимо от количества машин, используемых для отправки запросов.

Если пользователь или приложение отправляет более 10 запросов в секунду, дальнейшие запросы с IP-адреса (-ов) могут быть ограничены на короткий период.Как только количество запросов упадет ниже порогового значения на 10 минут, пользователь может возобновить доступ к контенту на SEC.gov. Эта практика SEC предназначена для ограничения чрезмерного автоматического поиска на SEC.gov и не предназначена и не ожидается, чтобы повлиять на людей, просматривающих веб-сайт SEC.gov.

Обратите внимание, что эта политика может измениться, поскольку SEC управляет SEC.gov, чтобы гарантировать, что веб-сайт работает эффективно и остается доступным для всех пользователей.

Примечание: Мы не предлагаем техническую поддержку для разработки или отладки процессов загрузки по сценарию.

Закон о американском плане спасения — Фонд восстановления ресторанов (RRF)

Обновлено 5/4

В понедельник, 3 мая, открыты заявки на участие в новой программе Фонда восстановления ресторанов (RRF) Управления малого бизнеса (SBA), предназначенной для помощи ресторанам и другим предприятиям, пострадавшим от пандемии COVID-19.

Обратите внимание, что все подходящих кандидатов теперь могут подать заявку, даже несмотря на то, что «в течение первых 21 дня, когда программа открыта, SBA будет отдавать приоритет заявкам на финансирование от предприятий, принадлежащих и контролируемых женщинами, ветеранами, а также социально и экономически неблагополучными лицами», SBA сказал.(Подробнее об этих приоритетных группах читайте дальше.)

Прочтите, чтобы узнать, как подать заявку, кто имеет право на участие, как рассчитать суммы гранта, на какие средства гранта можно использовать и многое другое. Заинтересованным компаниям также следует ознакомиться с Руководством по программе SBA (впервые выпущенным 17 апреля и последним обновленным 28 апреля), часто задаваемыми вопросами и образцом приложения для получения дополнительных сведений и обновлений.

Мы также недавно провели вебинар, на котором более подробно рассматриваются расчеты, процесс подачи заявок и другая важная информация.Зарегистрируйтесь, чтобы получить доступ к записи.

Фон

В соответствии с Законом об американском плане спасения от марта года был создан этот фонд стоимостью 28,6 млрд долларов, который будет находиться в ведении SBA специально для ресторанов и других операторов. Как и в случае с Программой защиты зарплаты (PPP), соискатели RRF должны предоставить добросовестное подтверждение того, что «текущая экономическая неопределенность делает этот запрос на финансирование необходимым для поддержки текущих или ожидаемых операций соискателя».

Эти гранты исключаются из налогооблагаемого дохода, и все расходы, оплачиваемые за счет поступлений от гранта, подлежат вычету в целях федерального налогообложения.

Кто имеет право на получение грантов РФС?

«Правомочные организации» определены как:

• Рестораны , продуктовые стойки, продуктовые тележки, продуктовые тележки, заведения общественного питания, бары, салоны, салоны, таверны, бары с закусками и безалкогольными напитками, «лицензированные помещения или помещения производителя алкогольных напитков, где публика может попробовать, попробовать или покупать продукты »или« другие аналогичные места ведения бизнеса, в которых люди или посетители собираются с основной целью — подать еду или напитки », включая организацию, расположенную в терминале аэропорта, организацию, которая действует независимо (имеет свою собственную налоговую идентификацию номер) внутри другого бизнеса (т.е., ресторан в отеле или конференц-центре) или предприятие, принадлежащее племени (любое предприятие, которое не менее 51% принадлежит индейскому племени).
  • Пекарни, пивоварни, дегустационные залы, пивоварни, пивоварни, мини-пивоварни, винодельни и ликеро-водочные заводы должны предоставить дополнительную документацию, подтверждающую, что не менее 33% валовой выручки за 2019 год были получены от продаж населению на местах.
  • гостиниц будут иметь право на участие, если продажи на месте продуктов питания и напитков населению составили не менее 33% от общей валовой выручки за 2019 год.
  • В Руководстве говорится: «Чтобы удовлетворить законодательное требование в отношении« места ведения бизнеса, в котором люди или посетители собираются с основной целью подачи еды или напитков », соответствующая организация должна иметь не менее 33% продаж на местах в 2019 году. публике. Исходная бизнес-модель правомочных организаций, которые открылись в 2020 году или еще не открылись, должна была предусматривать не менее 33% валовой выручки от продаж на месте населению. Предполагается, что организации, не требующие дополнительной документации, такие как рестораны и бары, осуществляют продажи на местах населению, составляющие не менее 33% валовой выручки в 2019 году.Все кандидаты должны подтвердить в заявке следующее: «Заявитель имеет право на получение финансирования в соответствии с правилами, действующими на момент подачи этой заявки».
• Организации должны быть организованы как корпорации C, корпорации S, товарищества, компании с ограниченной ответственностью, индивидуальные предприниматели, индивидуальные предприниматели, независимые подрядчики и племенные предприятия. Все другие формы организации не имеют права .
• Организации должны иметь действующий налоговый идентификационный номер (ИНН) , который может быть EIN, SSN или ITIN.Кандидаты должны предоставить ИНН для бизнеса и всех владельцев капитала 20% или более. Руководство включает подробную информацию о том, какие стороны считаются собственниками; какой тип номера использовать индивидуальному предпринимателю; и более; читайте для получения дополнительной информации или см. стр. 14 Руководства.
• Предприятие должно быть , в настоящее время открыто для ведения бизнеса; временно закрыт; или планируют открытие в ближайшее время, с расходами, понесенными по состоянию на 11 марта 2021 г.
• Субъекты не должны подавать заявление о банкротстве или должны действовать в соответствии с утвержденным (подтвержденным) планом реорганизации в соответствии с положениями главы 11, главы 12 или главы 13 о банкротстве.
• По состоянию на 13 марта 2020 г. организация должна владеть или управлять (вместе с любым аффилированным бизнесом) 20 или менее мест , «независимо от названия или типа бизнеса в этих местах»
  • Закон об американском плане спасения определил аффилированный бизнес как бизнес, в котором:
    • «правомочная организация имеет собственный капитал или право на распределение прибыли в размере не менее 50%», или
    • «приемлемая организация имеет договорное право контролировать направление бизнеса»
    В разделе часто задаваемых вопросов
    • SBA рассматриваются следующие вопросы, связанные с идентификацией аффилированных лиц:
      • «Индивидуальные предприниматели (и индивидуальные предприниматели) должны учитывать в качестве аффилированных лиц все предприятия, указанные в форме 1040 IRS, Приложение C.”
      • «Холдинговая компания (которая является компанией, которая владеет недвижимостью в интересах действующего бизнеса), единственной целью которой является владение недвижимостью для правомочного бизнеса Заявителя, не должна считаться местонахождением или аффилированным лицом».
      • «Однако, если бизнес-кандидат владеет холдинговой компанией или управляющей компанией, которая владеет или управляет бизнесом, отличным от бизнеса кандидата, вы должны учитывать эти организации как отдельные филиалы и местоположения.”
    • Перейдите в наш раздел «Местоположения, аффилированные лица, корпоративные группы и EIN» для получения дополнительной информации и рекомендаций, связанных с филиалами и несколькими местоположениями.
• Если заявитель работает по франшизе или «аналогичному соглашению, которое соответствует определению франшизы Федеральной торговой комиссии в 16 CFR 436», франшиза должна быть указана в Справочнике франчайзинга SBA или, если она не указана, должна предоставить Документ о раскрытии информации о франшизе (или другое соглашение) и все другие документы, которые франчайзи должен подписать для franchise @ sba.губ.

Субъекты, соответствующие требованиям НЕ :

• Организации, которые по состоянию на 13 марта 2020 года владеют или управляют (вместе с любым аффилированным бизнесом) более чем в 20 местах, независимо от названия или типа бизнеса в этих местах
• Постоянно закрытые предприятия
• Организации с истекшим сроком действия EIN, SSN или ITIN
• Юридические лица, заявившие о банкротстве по главе 7 или заявившие о банкротстве по главам 11, 12 или 13 и не действующие в рамках утвержденного (подтвержденного) плана реорганизации
• Публичные компании
• Организации, управляемые государством или местными органами власти
• Все некоммерческие организации
• Субъекты, ожидающие рассмотрения или утвержденные гранты в соответствии с разделом 324 Закона об экономической помощи малообеспеченным малым предприятиям, некоммерческим организациям и объектам , известные как Гранты операторам закрытых объектов (SVOG)

Приоритеты финансирования

SBA выделило средства из общей суммы RRF специально для малых предприятий .5 миллиардов долларов было выделено для правомочных организаций с валовой выручкой в ​​2019 году не более 500000 долларов; 4 миллиарда долларов для правомочных организаций с суммой от 500 001 до 1 500 000 долларов; и 500 миллионов долларов для правомочных организаций с доходом не более 50 000 долларов.

Кроме того, в течение первых 21 дня все гранты будут иметь приоритетное значение для малых предприятий, которые, по крайней мере, на 51% принадлежат и контролируются женщинами, ветеранами или другими социально и экономически неблагополучными группами (как определено в Разделах 3 (n), 3 (q) и 8 (a) (4) (A) Закона о малом бизнесе, соответственно, или см. Стр. 21 Руководства).Кандидат будет считаться имеющим право на этот приоритет, если по крайней мере 51% его собственности принадлежит одному или нескольким лицам, которые являются женщинами, ветеранами или социально и экономически неблагополучными, и если управление и повседневные деловые операции заявителя контролируются одним или побольше таких личностей. Кандидаты в RRF должны самостоятельно подтвердить, что они соответствуют всем требованиям.

Соискатели программы защиты зарплаты

Предприятие может получить как заем в рамках ГЧП, так и грант в рамках РФП, но потенциальные суммы субсидии в рамках ГЧП будут уменьшены на все полученные займы ГЧП (первого и второго займов).Таким образом, заявители, у которых находится заявка на получение кредита ГЧП, должны отозвать оставшуюся заявку на получение кредита в рамках ГЧП при подаче заявки на ФПИ.

Расчет суммы гранта

Правомочное предприятие может получить грант, равный сумме его « потери дохода, связанного с пандемией ». Потеря доходов, связанная с пандемией, обычно определяется путем вычитания валовой выручки за 2020 год из валовой выручки за 2019 год, хотя для предприятий, открывшихся в течение 2019 года или позже, существуют другие расчеты.

Убытки организации, связанные с пандемией, уменьшаются за счет любых полученных ссуд ГЧП (первой и второй займов).

В руководстве

SBA говорится, что «суммы, необходимые для расчета валовой выручки , зависят от типа налоговой декларации предприятия»; подробности см. на стр. 19.

При расчете валовой выручки заявитель не должен включать какие-либо полученные ссуды в рамках ГЧП, платежи по разделу 112 SBA, ссуды по программе EIDL (EIDL), авансы EIDL, целевые ссуды EIDL или любые государственные и местные субсидии для малого бизнеса (в соответствии с Законом CARES или иным образом), среди прочего, указанного в Руководстве (см. стр. 20).

Общая сумма гранта ограничена 10 миллионами долларов для каждой аффилированной группы ресторанов и дополнительно ограничена 5 миллионами долларов на физическое местоположение . Любой запрос на грант на сумму менее 1000 долларов США считается минимальным и поэтому не будет финансироваться.

Чтобы помочь операторам в расчете сумм грантов, SBA предоставило три отдельных расчета для правомочных организаций в зависимости от того, когда они начали свою деятельность. Узнайте больше о каждом расчете на нашем веб-семинаре, на котором мы обсудим их более подробно; или см. таблицы расчетов на страницах 6-8 примера приложения или пошаговые инструкции на страницах 7-9 Руководства.Но в целом их:

• Расчет 1: Самый простой из трех, который будет использоваться организациями, работающими на 1 января 2019 года или ранее. Как правило, это включает вычитание валовых поступлений за 2020 год из валовых поступлений за 2019 год и вычитание любых полученных займов ГЧП.
• Расчет 2: Для кандидатов, которые начали работу частично до 2019 года. Этот расчет обычно включает вычитание валовых поступлений за 2020 год из среднемесячных валовых поступлений за 2019 год, умноженных на 12, и вычитание всех полученных займов ГЧП.(Эти кандидаты также могут использовать Расчет 3.)
• Расчет 3: Для кандидатов, начавших работу в период с 1 января 2020 года по 10 марта 2021 года; и для заявителей, которые еще не открылись, но по состоянию на 11 марта 2021 г., но понесли соответствующие расходы. Эти кандидаты вычтут валовую выручку за 2020 и 2021 годы (до 11 марта 2021 года) из соответствующих расходов, понесенных в период с 15 февраля 2020 года по 11 марта 2021 года, и вычтут любые полученные ссуды в рамках ГЧП. Следует отметить, что Закон об американском плане спасения основывал расчеты этой группы только на их расходах на заработную плату ; Руководство теперь основывает его на всех приемлемых расходах , как описано ниже.

SBA поясняет, что «Для целей расчета суммы финансирования« в эксплуатации »означает день, когда организация начала осуществлять продажи. Это не означает день, когда Заявитель зарегистрировался у Государственного секретаря для создания юридического лица Заявителя ».

Приложение также включает расчет / Таблица 4 «для кандидатов, которые работают в нескольких местах с использованием разных расчетов», чтобы суммировать суммы вместе.

Обратите внимание, что любые исправлений после подачи будут перезапускать SBA рассмотрение и график платежей; SBA сообщает, что для завершения рассмотрения заявки может потребоваться «более 14 дней с момента повторной подачи».Исправления необходимо будет внести через портал приложений или по телефону, а также необходимо будет представить новую документацию. Никакие исправления вознаграждений после их выплаты не допускаются.

Допустимые расходы и страховой период

Полученные денежные средства в размере

РРФ могут быть использованы для любой из следующих статей в течение охватываемого периода с 15 февраля 2020 г. по 11 марта 2023 г. (Для постоянно закрытых организаций период покрытия заканчивается в дату закрытия или 11 марта , 2023, в зависимости от того, что наступит раньше.) Если правомочная организация не использует все средства гранта к установленному сроку, любые оставшиеся средства должны быть возвращены в Казначейство.

• Расходы на заработную плату , включая отпуск по болезни и расходы, связанные с продолжением группового медицинского обслуживания, жизни, инвалидности, зрения или стоматологических льгот в периоды оплачиваемого отпуска по болезни, медицинского или семейного отпуска, а также группового медицинского обслуживания, жизни, инвалидности , страхование зрения или стоматологическое страхование
• Платежи по любому обязательству по ипотеке (как основная сумма, так и проценты, но не предоплата основной суммы)
• Арендные платежи , включая арендную плату по договору аренды (без предоплаты)
• Обслуживание коммерческого долга (как основная сумма долга, так и проценты, но не предоплата основной суммы или процентов)
• Коммунальные предприятия «для распределения электроэнергии, газа, воды, телефона или доступа в Интернет, или любых других коммунальных услуг, которые используются в ходе обычной деятельности, для которых обслуживание было начато до 11 марта 2021 года.”
• Расходы на содержание , включая обслуживание стен, полов, поверхностей палуб, мебели, арматуры и оборудования. Хотя организации не смогут использовать средства для целей расширения, они могут использовать их для замены мебели, арматуры и оборудования (FF&E) или вышедших из строя грузовиков с едой, говорится в часто задаваемых вопросах SBA.
• Строительство уличных сидений
• Для целей расчета 3 амортизация является приемлемым расходом, говорится в FAQ SBA; однако SBA отметило на веб-семинаре, что ускоренная амортизация неприемлема.
• Принадлежности , в том числе СИЗ и чистящие средства
• Обычные Затраты на запасы продуктов питания и напитков , включая сырье для пива, вина или спиртных напитков
• Затраты на покрываемый поставщик , определяемые как «расходы, понесенные правомочной организацией поставщику товаров на поставку товаров, которые: являются существенными для деятельности организации в момент, когда производятся затраты; а также
  • «Сделано в соответствии с контрактом, заказом или заказом на поставку, действующим в любое время до получения средств на восстановление ресторана; или
  • «В отношении скоропортящихся товаров — контракт, заказ или заказ на поставку, действовавшие до или в любое время в течение страхового периода»
• Деловые операционные расходы , определяемые как «коммерческие расходы, понесенные в ходе обычных деловых операций, которые необходимы и являются обязательными для бизнеса (например,грамм. аренда, оборудование, расходные материалы, инвентарь, бухгалтерия, обучение, юриспруденция, маркетинг, страхование, лицензии, сборы). Операционные расходы бизнеса не включают расходы, которые происходят вне повседневной деятельности компании ». В Руководстве добавлено, что «просроченные расходы являются приемлемыми, если они были понесены начиная с 15 февраля 2020 года и заканчивая 11 марта 2023 года».

Годовая отчетность

Правомочные организации, получающие средства из РФП, должны будут сообщить в SBA не позднее декабря.31 января 2021 г., как они использовали свои средства на приемлемые расходы. Если к 31 декабря 2021 г. предприятие не израсходовало все свои средства, требование годовой отчетности сохраняется до тех пор, пока средства не будут израсходованы полностью. Организации должны подтвердить, что средства были потрачены на приемлемые расходы, и «SBA оставляет за собой право запросить дополнительную документацию, необходимую для подтверждения сертификата».

Как подать заявку?

Правомочное лицо может подать заявку на RRF через:

1.Признанный партнер SBA Restaurant Point of Sale (POS)

• Кандидаты, которые используют Toast или Square для POS-услуг, могут подать заявку напрямую через них и пропустить процесс подачи заявки в SBA.
• Кандидаты, использующие NCR Aloha, Clover, Oracle Micros, Heartland или Lightspeed / Upserve от Lightspeed, могут получить и предоставить от них официальную документацию; тем не менее, им по-прежнему необходимо подавать заявки через портал SBA самостоятельно.

2. Непосредственно через сайт SBA (Restaurants.sba.gov)

3. По телефону 844.279.8898

Для получения дополнительной информации см. Стр. 11 Руководства или просмотрите наш веб-семинар по запросу.

Что мне нужно в день подачи заявления?

• Заполненная форма SBA 3172 (заявление RRF; ее можно заполнить на портале SBA)
• Заполненная форма IRS 4506-T (ее можно заполнить на портале SBA)
• Информация о банковском счете для коммерческого коммерческого счета заявителя, включая выписки из банковского счета за три последних месяца («В случае индивидуальных предпринимателей, работающих без коммерческого счета, SBA потребует подтверждающую документацию, подтверждающую, что этот счет используется для ресторанных операций, и принадлежит индивидуальному предпринимателю », — отмечается в Руководстве)
  • Обратите внимание, что заявителей просят ввести свои банковские реквизиты, чтобы помочь проверить информацию об учетной записи, предоставленную через службу автоматического связывания.
• Документация о валовых поступлениях и / или приемлемых расходах в соответствии с требованиями для расчета суммы вашего гранта
  • Кандидаты, которые работали до или 1 января 2019 г .: Документация валовой выручки за 2019 г. и 2020
  • Кандидаты, которые начали работу частично до 2019 года и используют Расчет 2 : Документация валовых доходов за 2019 год и 2020
  • Кандидаты, которые начали работу частично в течение 2019 г. и используют расчет 3 : Документация валовой выручки за 2020 г.
  • заявителей, начавших работу в период с января по январь.1, 2020 и заканчивая 10 марта 2021 года и кандидатов, которые еще не открылись по состоянию на 11 марта 2021 года, но понесли приемлемые расходы: Документация валовых доходов и приемлемых расходов за время работы
  • Правомочная поддержка для валовой выручки состоит из:
    • Налоговые декларации предприятий
      • Для заявителей, которым необходимо подтвердить свои валовые поступления за 2019 год, налоговые декларации за 2019 год являются обязательным методом документирования
      • Федеральные налоговые декларации также являются предпочтительным методом для валовой выручки за 2020 год
    • отчетов POS, включая форму IRS 1099-K (еще один предпочтительный метод на 2020 и 2021 годы)
    • Форма 1040 Приложение C или F для индивидуальных предпринимателей
    • Внутренняя или внешняя финансовая отчетность, такая как отчеты о прибылях и убытках или отчеты о прибылях и убытках (подписанные, датированные и заверенные), будет принята, но может задержать обработку сверх 14-дневного периода
  • Поддержка приемлемых расходов состоит из:
    • Внутренняя или внешняя финансовая отчетность, такая как отчеты о прибылях и убытках или отчеты о прибылях и убытках (подписанные, датированные и заверенные), будет принята, но может задержать обработку сверх 14-дневного периода
    • Счета, платежные квитанции, отчеты о долгах предприятия и документы о заработной плате (например, формы 941 или другие отчеты о заработной плате от третьих лиц) также будут приняты, но рассмотрение заявки может быть отложено до 14 дней
  • Дополнительная документация требуется от организаций с требованиями «33% валовой выручки», как указано ранее:
    • Для пивоваренных заводов, ликероводочных заводов, виноделен, пивоварен, дегустационных залов, пивных, пекарен и прочего, необходимого для подтверждения того, что 33% их валовых доходов поступило от продаж на месте населению, заявитель может предоставить такие элементы, как любые налоги 2019 г. а также заполненные формы Торгового бюро, документация правительства штата или местного самоуправления или отчеты о запасах, продажах или бухгалтерском учете, созданные внутри компании.
    • Для организаций, работающих как гостиница, могут быть предоставлены такие документы, как внутренняя выручка или бухгалтерские отчеты, чтобы подтвердить требование 33% для продажи еды и напитков населению на месте.

Дополнительное руководство по EIN и праву собственности

Адреса, филиалы, корпоративные группы и EIN

• Ресторан или аналогичный бизнес с несколькими местами под одним и тем же EIN «должен подать заявку на все места в одной заявке.”SBA заявляет. «Кандидаты не могут подавать заявки от имени других организаций, таких как аффилированные или дочерние компании».
• Если заявитель владеет несколькими ресторанами (или аналогичными предприятиями), каждый из которых имеет свой собственный EIN и каждый подает свою собственную федеральную налоговую декларацию, каждый ресторан должен подать свое собственное отдельное заявление на ФПИ.
• Если у заявителя есть нескольких филиалов, работающих под одним EIN, с разными датами начала операций , сумма фонда может быть рассчитана с использованием нескольких методов расчета и увеличивая эту сумму до общей потенциальной суммы финансирования.
• Кандидаты с несколькими заявками на ФПИ с отдельными EIN, но с одной ссудой ГЧП. должны подать заявку на грант ФПИ, используя EIN для организации, получившей ссуду ГЧП первого розыгрыша, как указано SBA в часто задаваемых вопросах о ФПИ. Такой заявитель должен суммировать свои расчеты для отдельных местоположений, которые имеют право на получение RRF, и не может включать валовые поступления (или приемлемые расходы, если используется Расчет 3) из местоположений, которые не соответствуют критериям.
• Часто задаваемые вопросы SBA содержат следующие инструкции для ответа на вопрос приложения о том, есть ли у кандидата аффилированные лица:
  • «Вы должны выбрать« Да », если компания-заявитель, имеющая право на участие в RRF, имеет долю в капитале или право на распределение прибыли в размере 50% или более одного (или нескольких) других коммерческих организаций; и / или
  • «Вы должны выбрать« да », если какой-либо владелец 20% или более долей участия в праве на участие в программе-заявителе RRF имеет долю в капитале или право на распределение прибыли в размере 50% или более от одной (или более) другой коммерческой организации; и / или
  • «Вы должны выбрать« да », если бизнес-кандидат является холдинговой или управляющей компанией, которая владеет или управляет бизнесом, отличным от бизнеса кандидата, или если бизнес-кандидат принадлежит или управляется компанией, которая владеет или управляет другими бизнесами. вы должны считать эти организации отдельными филиалами и филиалами.
• Кандидаты, которые владеют или управляют одной корпоративной группой, насчитывающей более 20 офисов (независимо от того, соответствуют ли эти местоположения предприятиям, отвечающим требованиям RRF), не будут иметь права на получение RRF на уровне корпоративной группы или филиала.
• Кроме того, все филиалы, принадлежащие корпоративной группе, учитываются в соответствии с ограничениями RRF в отношении местоположений и максимальной суммой финансирования в 10 миллионов долларов.
• Согласно текущему руководству SBA FAQ: «Когда физические или юридические лица прямо или косвенно владеют или контролируют несколько местоположений, все местоположения должны учитываться при учете максимального предела в 20 местоположений для получения права на участие и совокупного лимита в 10 миллионов долларов на финансирование RRF.Это включает в себя любые места, которые работают под отдельными налоговыми идентификационными номерами или названиями, и применяется независимо от того, осуществляется ли владение или контроль через физическое лицо, управляющие или холдинговые компании или другие организации. Все местоположения должны быть засчитаны, даже если они не имеют права на получение RRF. Что касается программы RRF, SBA рассматривает владельцев обыкновенных акций и / или операторов как корпоративную группу де-факто. Это относится даже к LLC, которые не являются юридическими лицами ».
• Мы, , настоятельно рекомендуем, , чтобы все заинтересованные кандидаты, имеющие проблемы с корпоративной группой или аффилированными лицами, обратились за юридической консультацией, чтобы определить применение этих правил к их индивидуальной ситуации.

Собственность

Кандидаты должны указать всех владельцев 20% или более бизнеса в заявке. Общая сумма капитала, указанная в заявке среди этих владельцев (с «собственниками», определенными SBA как включая индивидуальных предпринимателей, партнеров с ограниченной ответственностью, членов LLC или доверительных управляющих), не должна составлять 100% всего непогашенного капитала, если все В списке указаны 20% или более владельцев. Если ни один из владельцев не имеет как минимум 20% собственности, заявитель должен указать владельцев, совокупный капитал которых составляет не менее 20% собственности правомочной организации.

Владельцы должны быть указаны с их EIN, SSN или ITIN. «Если владелец 20% или более бизнеса не имеет SSN или ITIN, бизнес НЕ имеет права», — заявляет SBA.

_{Настоящий документ подготовлен только для информационных целей и общего руководства и не является юридической или профессиональной консультацией. Вы не должны действовать в соответствии с информацией, содержащейся в этой публикации, без специальной профессиональной консультации. Не делается никаких заявлений или гарантий (явных или подразумеваемых) в отношении точности или полноты информации, содержащейся в этой публикации, и CohnReznick LLP, ее члены, сотрудники и агенты не несут ответственности и отказываются от любой ответственности за последствия, которые могут возникнуть в вашей или кто-либо другой, действующий или воздерживающийся от действий, полагаясь на информацию, содержащуюся в этой публикации, или на любое решение, основанное на ней.}

Функциональный анализ ядерной реорганизации на раннем этапе эмбрионального развития: на примере генов рРНК

Функциональный анализ ядерной реорганизации во время раннего эмбрионального развития: на примере генов рРНК

Soumis par: Bonnet-Garnier Amelie
Тип резюме: Плакат
Сессия: Accueil
Автор Оратор: А.Бонне-Гарнье
Полный список авторов — Место работы:

М. Чебру ¹ , мкр. Koné ¹ , P. Adenot ¹ , R. Fleurot ¹ , T. Aguirre-Lavin ¹ , N. Beaujean ¹ и A. Bonnet-Garnier ^{1 *}

¹ UMR BDR, INRA, ENVA, Université Paris Saclay, 78350, Jouy en Josas, France

^* автор-корреспондент

Резюме:

Во время предимплантационного периода вновь сформированный эмбрион подвергается геномной активации и первой дифференцировке, чтобы обеспечить его развитие до срока.Эти ключевые события коррелируют с изменением состояний транскрипции различных групп генов, но также и с крупномасштабными модификациями организации хроматина. Следовательно, этот период может быть полезен для оценки связи между пространственной организацией гена и его транскрипционным состоянием на уровне отдельной клетки.

В этом контексте мы исследовали организацию рибосомных генов (рДНК) с помощью подходов 3D-FISH (флуоресцентная гибридизация in situ на сохраненных в 3D ядрах) на эмбрионах мыши.Эти гены, повторяющиеся в тандемном массиве рядом с перицентромерными областями и специфически транскрибируемые РНК-полимеразой I, выключены у эмбрионов на стадии 1 клетки. Затем, в конце 2-клеточной стадии, начинается синтез рРНК. Исследование было проведено с и без присутствия нового лекарственного средства, CX-5461, которое специфически ингибирует pol I РНК. Мы также исследовали относительное положение этих генов по отношению к перицентромерному гетерохроматину.

Мы наблюдали, что у эмбрионов на 1-клеточной и ранней 2-клеточной стадиях рибосомные последовательности сгруппированы в чрезвычайно сжатые очаги и сопоставлены с основными сателлитными последовательностями, которые образуют прерывистое кольцо вокруг ядрышкообразных структур.С другой стороны, на поздней 2-клеточной стадии рибосомные последовательности образуют структуры ожерелья и меньше контактируют с перицентромерными областями. Позже, на стадиях 4 и 8, последовательности рРНК становятся высокодисперсными и образуют облако, которое почти полностью заполняет внутреннюю часть тел-предшественников ядрышка. В присутствии препарата эмбрионы прекращали свое развитие на 4-клеточной стадии. После 72 часов лечения продукция рРНК действительно подавляется, и ген рРНК становится кластером.Эти результаты предполагают тесную связь между пространственной организацией (расслабленной или кластерной) последовательностей рибосомных генов и их транскрипционными состояниями (активными или молчащими).

Библиографические ссылки:

Моц .: эмбрион, мышь, рДНК, ядрышко, 3D-FISH
Документы: abstract-ABonnetGarnier_2016.docx 15,45 Кбайт

Школа реорганизации образования | Педагогическая школа

Педагогическая школа Питтсбургского университета реализовала амбициозный план реорганизации, чтобы лучше поддерживать активную академическую структуру и новую административную конфигурацию нашей школы. Реорганизация позволяет нам выполнить нашу миссию — зажечь обучение вместе со студентами, семьями, сообществами и с самими собой.

Напишите нам по адресу SOE_Reorg @ pitt.edu, если у вас есть вопросы по реорганизации.

---

Расширенная академическая структура

Педагогическая школа Университета Питтсбурга, в которой раньше было шесть академических единиц, теперь будет разделена на три академических отдела. Эта реструктуризация обеспечит более интерактивный академический опыт для студентов, усиление междисциплинарного сотрудничества в нашей школе и расширенные возможности для взаимодействия между студентами, преподавателями и сотрудниками. Кроме того, это обеспечит более прозрачную операционную инфраструктуру и более эффективное администрирование.

Новые кафедры

Кафедры служат в нашей Школе академическими домами для студентов, преподавателей и сотрудников, что способствует их обучению, преподаванию, исследованиям и работе.

• Образовательные фонды, организации и политика
• Здоровье и человеческое развитие
• Преподавание, обучение и лидерство

Новые учебные подразделения

Учебные подразделения по своей природе являются кросс-функциональными и обеспечивают практическую экспертизу академических программ.

• Научно-исследовательская подготовка
  • Программы докторантуры и магистерские программы, ориентированные на исследования
• Инновационное лидерство
  • программа EdD; руководители, районные и общинные руководители
• Бакалавриат и послевузовское профессиональное обучение
  • Педагогическое и профессиональное образование; практические программы магистратуры; программы сертификации, вмешательства и непрерывного образования

---

Улучшенное физическое пространство

Одновременно с реорганизацией Педагогическая школа претерпела капитальный ремонт на пятом этаже здания Уэсли В.Посвар Холл. Ремонт создает более привлекательное, современное и хорошо функционирующее пространство для студентов, преподавателей и сотрудников.

После ремонта наша школа добавила к нашему пространству следующие нововведения: расширенную комнату для коллоквиума декана для больших собраний, приветственный центр, комнату для взаимодействия со студентами и большие учебные зоны для студентов. Кроме того, в результате ремонта появились новые рабочие места для преподавателей и сотрудников, а также больше открытых площадок для сотрудничества. Мы благодарны за финансовую поддержку, оказанную Офисом Провоста Университета Питтсбурга.

---

Реорганизация Часто задаваемые вопросы

Почему Педагогическая школа была реорганизована?

Под руководством декана Валери Кинлох наша школа образования определила необходимость реорганизации, чтобы лучше придерживаться и выполнять наше новое видение миссии (см. Видео). Ключевые элементы нашей миссии-видения — стимулировать обучение, стремиться к благополучию для всех, разрушать и преобразовывать несправедливые образовательные структуры, а также агитировать и вводить новшества.

Наша новая академическая структура позволяет нашей школе лучше реагировать на вызовы и возможности в образовании. Это также позволяет повысить эффективность, что снизит затраты и позволит школе лучше сотрудничать со студентами, преподавателями, персоналом, выпускниками и более широким сообществом.

Что изменится в результате реорганизации, а что останется прежним?

Реорганизация изменила академическую структуру нашей школы за счет сокращения количества академических отделов с шести до трех академических отделов, что упрощает услуги и сокращает дублирование.Раньше нашими академическими отделами были: административные и политические исследования, Центр городского образования, здоровья и физической активности, обучения и обучения, учебных наук и политики и психологии в образовании. Нашими тремя новыми академическими отделами школы будут: «Основы образования», «Организация» и «Политика»; Здоровье и человеческое развитие; и преподавание, обучение и лидерство.

Кроме того, в результате реорганизации были созданы три новых учебных подразделения: Research Training, Innovative Leadership, а также бакалавриат и последипломное профессиональное обучение.Эти подразделения будут нести ответственность за работу с нашими академическими отделами и между ними для достижения наших стратегических целей в отношении улучшения учебных программ, разработки новых программ, а также приема и зачисления.

Несмотря на то, что происходит множество изменений, наша Школа по-прежнему привержена принципам равенства, справедливости и инноваций в образовании, здравоохранении и человеческом развитии, и мы продолжаем серьезно относиться к нашему партнерству со студентами, семьями и сообществами.

Как реорганизация повлияет на меня как на студента, преподавателя, сотрудника или выпускника?

Реорганизация окажет положительное влияние на наше школьное сообщество.Наша цель — сделать каждый этап реорганизации прозрачным.

• Студенты — Мы ожидаем, что влияние на студентов будет ограниченным, поскольку реорганизация усилит существующие и создаст новые академические программы и улучшит наши структуры консультирования и наставничества. В целом, мы уверены, что это улучшит опыт учащихся, сделав нашу школу менее разделенной на академические отделы.
• Факультет — В результате реорганизации факультет будет реорганизован в новые академические подразделения и будет участвовать в новых учебных подразделениях.Преподаватели могут рассчитывать на взаимодействие с более совместной структурой, которая предоставит расширенные возможности для междисциплинарной работы.
• Персонал — В результате реорганизации персонал может быть реорганизован в новые академические отделы и может иметь более заметные роли и обязанности.
• Выпускники — Реорганизация поможет нам повысить важность информирования и вовлечения выпускников.

Каковы сроки завершения реорганизации?

Педагогическая школа получила официальное одобрение на реорганизацию 1 января 2020 года.Разработка и внедрение процессов и процедур реорганизации произойдет весной 2020 года.

В чем разница между академическими отделами и академическими подразделениями?

Новая структура академических отделов и учебных подразделений важна для новой структуры нашей школы.

Академические отделы — это академические дома для студентов, преподавателей и сотрудников, особенно когда речь идет о преподавании, исследованиях и функциональных областях.Помимо прочего, академические отделы сосредоточены на обучении, улучшении учебных программ, зачислении на курсы и соответствующих действиях преподавателей и сотрудников. Они также сосредотачиваются на создании и поддержании культуры сотрудничества между отделами, которая улучшает то, как мы говорим и участвуем в творческих формах обучения, исследований и стипендий, консультирования и наставничества.

Учебные подразделения являются кросс-функциональными по своей природе и включают преподавателей и сотрудников различных академических отделов, которые работают на уровне школы.Они несут ответственность за многие важные вещи, такие как процессы утверждения программ и изменения курса, и они сотрудничают с другими при приеме на работу и зачислении, а также составлении карты учебных программ для всех академических единиц.

Реорганизация глобальной метаболической сети с помощью адаптивных мутаций обеспечивает быстрый рост Escherichia coli на глицерине

На поглощение глицерина влияют мутации

glpK и rpoC

Мы использовали ¹ H-ЯМР-спектроскопию для отслеживания изменений концентрации глицерина. культуральная среда в разные моменты времени во время экспоненциального роста с оптической плотностью (OD) ₆₀₀ 0.05–0,75 для оценки скорости поглощения глицерина. Штаммам DKI потребовалось около 10 часов для достижения OD ₆₀₀ 0,75, что быстрее, чем у штаммов RPOC (11 часов), GLPK (13 часов) и WT (16 часов). Измененные скорости роста (рис. 1a) связаны с различиями в размере клеток, как и ожидалось, и все данные и анализ в этом исследовании принимают во внимание размер клеток для нормализации концентраций (см. Раздел «Методы» и дополнительный рис. 1). Для всех изученных штаммов мы обнаружили, что менее половины доступного глицерина было израсходовано в последней точке отбора проб, что показывает, что глицерин не ограничивал в ходе эксперимента (дополнительный рис.2). По сравнению со штаммом WT скорость поглощения глицерина для всех штаммов с одним и двумя мутантами была увеличена на 30–66% (рис. 1b).

Рисунок 1: Параметры роста WT и мутантных штаммов.

( a ) Скорость роста WT и мутантных штаммов на глицерине. Значения P были получены с использованием теста t , сравнивающего штаммы мутантов с WT (*** P <0,001). ( b ) Скорость поглощения глицерина (* P <0,05, *** P <0.001, т. -тест по сравнению с WT). ( c ) Расход глицерина (* P <0,05, ** P <0,01, двухгрупповое сравнение с использованием теста t ). Графики показывают среднее значение ± стандартная ошибка. ( n = 6).

В качестве показателя выхода биомассы мы отслеживали количество глицерина, израсходованного на каждую единицу увеличения оптической плотности культуры для каждого штамма (рис. 1c). В соответствии с предыдущими результатами ¹¹ , выход биомассы был увеличен мутацией rpoC (выраженный как снижение потребления глицерина при одинаковом увеличении биомассы), хотя он рос быстрее, чем WT и GLPK (рис.1а). Это говорит о том, что штаммы с этой мутацией более эффективны в преобразовании биомассы. Напротив, мутация glpK вызвала повышенное потребление глицерина для эквивалентного выхода биомассы, предполагая, что эта мутация ускоряет рост за счет увеличения, но менее эффективного использования углерода.

Мутация

rpoC улучшает метаболическую эффективность

Чтобы выяснить основные последствия адаптивной эволюции, мы провели комбинацию метаболомного, липидомного и протеомного анализов штаммов.Для метаболомики мы идентифицировали 121 метаболический признак, присутствующий во всех образцах, с помощью масс-спектрометрии с капиллярным электрофорезом (дополнительный рисунок 3 и дополнительные данные 1). При OD ₆₀₀ 0,25 на концентрации 68 метаболитов значимо повлияла мутация rpoC (рис. 2a, двусторонний дисперсионный анализ, скорректированный по Бонферрони P <0,05, n = 6) , выявляя основные изменения в метаболоме, вызванные этой специфической мутацией. Кроме того, 23 изменения метаболита наблюдались в результате мутации glpK (дополнительный рис.4). Большие и специфичные для штаммов различия в профилях метаболитов также очевидны в результатах многомерного анализа (частичный дискриминантный анализ методом наименьших квадратов; PLS-DA) метаболомных данных, собранных для всех штаммов и точек отбора проб. Штаммы были четко разделены на основе их генотипа rpoC в первом компоненте PLS-DA и на основе их генотипа glpK во втором компоненте PLS-DA (рис. 2b).

Рисунок 2: Широкие метаболические изменения, связанные с мутацией rpoC , увеличивают метаболическую эффективность.

( a ) Тепловая карта подмножества 68 идентифицированных метаболитов, исследованных при OD ₆₀₀ 0,25 (ранняя экспоненциальная фаза), на концентрации которых значительно повлияла мутация rpoC (все скорректированные по Бонферрони P < 0,05). Метаболиты упорядочены путем увеличения значения P сверху вниз (цвета указывают минимальную – максимальную нормированную относительную концентрацию: синий — минимальная концентрация; красный — максимальная концентрация). ( b ) PLS-DA анализ глобальных метаболомных данных для всех 121 метаболита при OD ₆₀₀ из 0.25, 0,45 и 0,75 (R ² X = 0,43, R ² Y = 0,77, Q ² = 0,74 для первых трех компонентов). ( c ) Специфические изменения в соотношении метаболитов НАД (Ф). ( d ) Специфические изменения липидных метаболитов и ( e ) специфические изменения выбранных экзо-метаболитов. ( f ) Краткое изложение основных протеомных изменений, вызванных мутацией rpoC . Графики в c — e показывают среднее значение ± s.e. ( n = 6). P значений, полученных из двухфакторного дисперсионного анализа ( n = 18).Все значения в d , e рассчитаны относительно уровней в WT при OD 0,25 (100%).

На рис. 2а наиболее ярким и глобальным изменением метаболического состояния является снижение концентрации большинства метаболитов, вызванное мутацией rpoC . Мы исключили, что эффекты объема клеток между штаммами (разведение) могут быть ответственны за общее снижение большинства метаболитов (см. Методы и дополнительный рис. 1). Заметные исключения включают увеличение обоих восстановленных динуклеотидных окислительно-восстановительных кофакторов НАДН и НАДФН, аденина, дАДФ, никотинамида и путресцина.Большинство этих изменений также было отражено аналогичными изменениями в штамме DKI. Соотношения восстановленных / окисленных метаболитов были рассчитаны для лучшего описания окислительно-восстановительного состояния и показаны на рис. 2c). Для WT наблюдаемые соотношения восстановленных / окисленных динуклеотидов были сопоставимы с ранее сообщенными данными для WT на среде с минимальным содержанием глюкозы (NADH / NAD ⁺ , 0,31; NADPH / NADP ⁺ , 1,05) ¹ . Однако для штаммов RPOC и DKI мутация rpoC вызывала в среднем пятикратное увеличение отношения NADH / NAD ⁺ и семикратное увеличение отношения NADPH / NADP ⁺ по сравнению со штаммами WT и GLPK.Соотношения нескольких других ключевых репортеров окислительно-восстановительного и азотного метаболизма показаны на дополнительном рисунке 5. Значительное увеличение соотношений восстановленных / окисленных динуклеотидов после мутации rpoC обеспечивает драйвер анаболизма, что отражается в более низком энергетическом заряде при уменьшении Соотношения глутамин-глутамат / 2-кетоглутарат предполагают высокий обмен азота для производства аминокислот / белков (дополнительный рис. 5). В соответствии с этим открытием, штаммы RPOC и DKI показали повышенные уровни белков, участвующих в синтезе жирных кислот (FabAB) и сборке пептидогликана (MurA), а также в биогенезе рибосом (ObgE, DeaD; дополнительный рис.6). В совокупности эти результаты предполагают, что мутация rpoC улучшает рост за счет значительной реорганизации метаболической сети, которая отражает повышенные анаболические потребности, чтобы справиться с быстрым ростом. Более того, поскольку эффекты увеличения скорости роста мутации rpoC наблюдаются только на минимальных средах ¹¹ , эти глобальные изменения также можно интерпретировать как изображение реакции, оптимизирующей синтез большинства предшественников биомассы, что может объяснять обычно более низкие уровни метаболитов-предшественников.

Чтобы подробнее изучить метаболический эффект адаптивных мутаций, мы провели липидомный анализ. В соответствии с известными основными видами липидов в E. coli ^13,14,15,16 , мы наблюдали 22 липида в основном в форме фосфатидилэтаноламина и фосфатидилглицерина. Интересно отметить, что основные изменения в липидном составе были связаны с мутацией rpoC , поскольку штаммы RPOC и DKI показали резко сниженные концентрации фосфолипидов, содержащих циклопропановые жирные кислоты (CFA), такие как cy17: 0 и cy19: 0 (рис.2d и дополнительный рис. 7). Протеомные данные также показали, что уровень CFA-синтазы (Cfa), ключевого фермента циклопропанирования, был снижен в шесть раз как в штаммах RPOC, так и в штаммах DKI (дополнительный рис. 6), что подтверждает и объясняет происхождение изменений в липидах, содержащих циклопропан. Предыдущие исследования показали, что циклопропанирование жирных кислот, модификация липидов после синтеза, обычно начинается, когда клетки входят в стационарную фазу, пока все ненасыщенные жирные кислоты не изменятся в соответствующие им CFA (например, модификация с 16: 1 до cy17: 0) ¹⁷ .Преобразование является энергетически затратным, так как три АТФ необходимы для образования молекулы S -аденозилметионина, которая затем используется в качестве донора метила для циклопропанирования ¹⁷ . Таким образом, эти липидомные результаты показали, что мутация rpoC способствует экономии энергии за счет подавления этого дорогостоящего процесса модификации липидов.

Функция циклопропанирования жирных кислот до сих пор полностью не изучена, хотя известно, что CFA улучшают устойчивость клеток к кислотному стрессу ¹⁷ .В соответствии со снижением Cfa, ряд других белков кислотостойкости (включая GadABC, HdeAB и Slp) также сильно подавлялся (97–99% снижение) мутацией rpoC (дополнительный рис. 6). Этот результат также согласуется с предыдущими исследованиями, показывающими подавление генов кислотной устойчивости в штамме RPOC ^11,18 . Кроме того, стационарная фаза и вызванные стрессом белки, включая Dps, MscS, OsmE, OsmY и Sra, также были снижены на 64–81% в штаммах RPOC и DKI.Интересно, что уровень алармона ppGpp был снижен как у штаммов RPOC, так и у DKI, хотя разница не была статистически значимой. В совокупности эти результаты предполагают, что мутация rpoC избавляет E. coli от стресса и реакций, вызванных стационарной фазой во время роста на глицерине, и позволяет повторно использовать метаболические ресурсы для увеличения выхода биомассы. Однако было обнаружено, что регулятор реакции на стресс, RpoS, повышен у штамма RPOC, хотя уровень RpoD также был выше у штаммов RPOC и DKI.Повышенный уровень RpoS может быть связан с пятикратным увеличением концентрации путресцина в клетках штамма RPOC (рис. 2а) ^19,20 . Хотя точный молекулярный механизм еще предстоит выяснить, возможно, что эта специфическая мутация rpoC влияет на его взаимодействия с сигма-факторами rpoD и rpoS , тем самым влияя на стрессовую реакцию. Предыдущее исследование показало, что некоторые мутации rpoC могут значительно изменять экспрессию генов, особенно те, которые связаны с подвижностью и кислотной устойчивостью ¹¹ .

Анализ экзо-метаболома показал значительно сниженную секрецию N -ацетиласпартата и промежуточных продуктов пиримидинового пути (включая карбамоиласпартат, дигидрооротат и оротат) как в штаммах RPOC, так и в DKI по сравнению со штаммами WT и GLPK (рис. 2e). О секреции этих метаболитов E. coli сообщалось до ²¹ , а промежуточные продукты биосинтеза пиримидинов, как известно, накапливаются в E. coli K-12 из-за мутации в rph / pyrE ^{21 , 22} .Эти наблюдаемые изменения в экзо-метаболоме хорошо коррелируют со снижением внутриклеточных концентраций тех же метаболитов (рис. 2a), а также со сниженным уровнем ферментов (PyrBCI), участвующих в пути биосинтеза пиримидина (рис. 2f и дополнительный рис. 6). Вопреки тому, что можно было ожидать, белок PyrE не был обнаружен ни в одном штамме, что позволяет предположить, что снижение накопления вряд ли связано с повышенным уровнем экспрессии фермента, что согласуется с более ранним исследованием ¹¹ .Тот факт, что промежуточные продукты пиримидина не секретируются в больших количествах в штамме RPOC и что некоторые ферменты, необходимые для их биосинтеза, фактически подавлены, предполагает, что либо биосинтез пиримидина не является узким местом для быстрого роста, либо активность фермента PyrE регулируется другими способами, которые не регулируются. вовлекают повышенное выражение. Более того, тот факт, что другие ферменты (PyrBCI), которые, как известно, негативно регулируются конечными продуктами пути, уменьшаются в RPOC, предполагает, что пиримидинов достаточно для удовлетворения потребностей роста, а также способствует ограничению менее эффективной секреции промежуточных продуктов.Интересно отметить, что снижение этих промежуточных соединений даже более выражено в DKI, чем в штамме RPOC (эпистаз), разница, которая может быть связана с более быстрым ростом DKI.

В совокупности приведенные выше результаты показывают, что мутация rpoC перепрограммирует E. coli для улучшения выхода биомассы путем подавления накопления метаболитов и процессов потери энергии, таких как постсинтетическая модификация липидов, стресс и реакции, вызванные стационарной фазой, реакции выброса углерода и секреция (рис.2е). Интересно, что это системные и скоординированные ответы, возникающие в результате одной мутации, показывающие, что она действует через несколько механизмов, как сообщали другие ^2,23 .

Мутация

glpK улучшает утилизацию глицерина

В то время как мутация rpoC переключает E. coli в режим экономии углерода и высокой эффективности, характер утилизации глицерина мутантного штамма glpK предполагает, что эта мутация способствует увеличению рост клеток по другому механизму.Эта метаболическая разница очевидна по более высокой секреции ацетата как для штаммов GLPK, так и для DKI (рис. 3a). Производство и секреция ацетата — это механизм перелива, который обычно интерпретируется как результат дисбаланса между поглощением / доступностью углерода и способностью метаболической сети использовать его для производства энергии и биомассы ²⁴ . С другой стороны, это также важный источник генерации энергии за счет фосфорилирования на уровне субстрата ²⁵ . В дополнение к секреции ацетата мы обнаружили, что как штаммы GLPK, так и DKI также секретируют значительные уровни D-лактата (рис.3б), сукцинат и пируват (рис. 3в). Этот повышенный уровень образования смешанных кислот предполагает, что более высокая скорость поглощения глицерина, вызванная мутацией glpK , превышает потребность или способность клеточного метаболизма использовать увеличенный поток углерода для образования биомассы. Примечательно, что продукция D-лактата особенно высока у штамма DKI, что может быть связано с комбинированным эффектом высокого потока углерода и повышенным соотношением кофактора NADH / NAD ⁺ (рис. 2c). В целом, 23% потребленного глицерина было преобразовано в ацетат и лактат в штамме DKI, затем следуют GLPK (20%), RPOC (16%) и, наконец, WT (15%).

Рис. 3. Метаболические изменения, связанные с мутацией glpK , приводят к усилению метаболизма переполнения.

( a ) Повышенная секреция ацетата и, ( b ), D-лактата или ( c ) цАМФ, сукцината и пирувата. Графики показывают среднее значение ± стандартная ошибка. Значения P были получены в результате двустороннего дисперсионного анализа (** P <0,01, *** P <0,001, n = 6 для a и b , и n = 18 для c ).( d ) Предложенный механизм метаболических эффектов мутации glpK , основанный на данных протеомики и метаболомики. Все значения в c рассчитаны относительно уровней в DKI при OD 0,75 (100%).

Наблюдаемый здесь тип углеродного переполнения (рис. 3d) согласуется с предыдущим исследованием ²⁶ , которое связывало переполнение с катаболитной репрессией на глюкозе и пониженными концентрациями ацетил-КоА-синтетазы и циклического АМФ (цАМФ). В настоящем исследовании ацетил-КоА-синтетаза, ключевой белок для утилизации ацетата, была заметно подавлена ​​(снижение на 93%) как в штаммах GLPK, так и в штаммах DKI.Кроме того, уровень цАМФ во внеклеточной среде был значительно снижен присутствием мутации glpK (рис. 3c). Предыдущее исследование показало пониженный уровень внутриклеточного цАМФ в штамме GLPK, и этот результат был согласован с тремя другими штаммами knock-in с различными адаптивными мутациями glpK ¹⁰ . Это наблюдение дополнительно подтверждается на уровне протеома двукратным снижением белка рецептора цАМФ (Crp) в штаммах GLPK и DKI (дополнительный рис.6).

В WT E. coli уровни цАМФ-Crp выше во время роста на глицерине по сравнению с ростом на глюкозе ²⁷ . Поскольку цАМФ-Crp активирует гены цикла трикарбоновых кислот (ТСА), образование ацетата ограничено глицерином, обычно неферментируемым источником углерода. С другой стороны, скорость поглощения глицерина была увеличена в мутанте glpK , скорее всего, из-за пониженного ингибирующего действия фруктозо-1,6-бисфосфата на GlpK, как показано ранее для этого мутанта ¹⁰ .Это приводит к увеличению переноса фосфата из фосфорилированного EIIA ^Glc с образованием глицерин-3-фосфата ²⁸ . Результирующее снижение фосфорилированного EIIA ^Glc , в свою очередь, снижает активность аденилатциклазы и продукцию цАМФ. Это может затем привести к подавлению активности цикла TCA, что подтверждается сниженными уровнями нескольких ферментов цикла TCA (GltA, AcnAB, FumAC, SucBCD и Mdh), глиоксилатного шунта (AceA и AceB) и глюконеогенеза (Pck , Pps и MaeB).Вместе эти эффекты приводят к избыточному метаболизму и производству ацетата, пирувата и лактата. Кроме того, накопление промежуточных продуктов пиримидинового пути (карбамоиласпартат, оротат и дигидрооротат) также представляет собой форму избыточного метаболизма ²¹ , хотя результаты RPOC предполагают, что это может быть неоптимальным. Снижение цАМФ-Crp также отражается в подавлении транспортеров, таких как MglB (галактоза), RbsB (рибоза), CstA (пептиды), DppA (дипептиды), GatABC (галактитол), GlnH (глутамин), MtlA (маннитол). ) и NagE ( N -ацетилглюкозамин; дополнительный рис.6). Таким образом, снижение уровней цАМФ в штаммах, содержащих мутацию glpK , по-видимому, отвечает за превращение глицерина в наблюдаемые метаболиты избытка. Другая интересная возможность состоит в том, что мутация glpK , влияя на уровни цАМФ, может способствовать лучшей оптимизации протеомных ресурсов для метаболических потребностей, как недавно было предложено ²⁹ . Это предполагает, что эти потребности плохо скорректированы в WT E. coli , что приводит к более медленному, чем ожидалось, росту.

На основании этих результатов мы предполагаем, что снижение уровней цАМФ и повышенное использование и переполнение глицерина, которые индуцируются мутацией glpK , вместе приводят к увеличению скорости роста. Следует отметить, что эти изменения не наблюдались в штамме RPOC, который демонстрирует промежуточную скорость роста между штаммами GLPK и DKI. Повышенный поток углерода, вероятно, обусловлен улучшенной кинетикой мутантного GlpK, а также сниженным ингибированием 1,6-бисфосфатом фруктозы, хотя уровень GlpK фактически снижается в штамме GLPK (дополнительная таблица 1) ¹⁰ .Снижение экспрессии GlpK может показаться противоречивым ответом, но ранее предполагалось, что оно связано с катаболитной репрессией оперона glpFKX из-за пониженных уровней цАМФ, и предполагалось, что оно важно для ограничения токсичности метилглиоксаля ¹⁰ . Взятые вместе, мутация glpK , по-видимому, способствует росту клеток за счет увеличения поглощения глицерина до уровня, который может превосходить потребности и возможности клеточного метаболизма, что приводит к увеличению неэффективного переноса углерода. Предыдущие исследования показали, что менее эффективный метаболизм переполнения может быть предпочтительным, когда источник углерода не ограничен, и защищает от токсичности метилглиоксаля ³⁰ .Перелив также был предложен как компромисс между выходом энергии и биомассы и биосинтетическими затратами дыхания, которые происходят во время быстрого роста ³¹ . Кроме того, конкуренция за мембранное пространство между поглощением субстрата и дыханием также была предложена как ограничение, ведущее к растрате углерода ³² . Наши результаты показывают, что штаммы GLPK и RPOC могут предпочтительно использовать переток / ферментацию и дыхание, соответственно, в то время как DKI оптимизировал баланс между этими процессами и выходом биомассы для достижения максимальной скорости роста.Эти результаты хорошо согласуются с известными компромиссами между урожайностью и темпами роста в процессе эволюции ^33,34 .

Эпистатические эффекты мутаций

rpoC и glpK

Мутации в генах glpK и РНК-полимеразы ( rpoB / C ) были неоднократно обнаружены в эволюционировавших из 8 глицерина штаммах ^{E. coli , что указывает на возможное взаимодействие между этими двумя мутациями в улучшении приспособленности и роста.Основываясь на результатах, мы предполагаем, что мутация rpoC может улучшить скорость роста, вызывая реакцию экономии углерода, которая ограничивает несущественные метаболические активности для оптимального использования глицерина и выхода биомассы. В таком режиме экономии углерода узким местом для производства биомассы становится уровень поглощения и использования глицерина, который преодолевается мутацией в гене glpK . Совокупный вклад мутаций rpoC и glpK в скорость роста штамма DKI примерно на 10% больше, чем сумма их индивидуальных эффектов, показывающая, что мутации являются эпистатическими (рис.4). Штамм DKI может также иметь улучшенную способность противодействовать токсичности метилглиоксаля, что показано в его более сбалансированном окислительно-восстановительном состоянии (дополнительный рисунок 5) и сниженной экспрессии нескольких ферментов, участвующих в детоксикации метилглиоксаля (AldA, Dld и HchA и DkgA; дополнительная таблица 1 ).}

Рисунок 4: Предполагаемый механизм действия адаптивных мутаций в rpoC и glpK на метаболический фенотип.

В то время как мутация rpoC запускает углеродосберегающее метаболическое состояние, способствующее оптимальному использованию глицерина, мутация в гене glpK дает преимущество роста за счет увеличения поглощения глицерина с сопутствующим повышенным выбросом углерода.Метаболический вклад мутаций rpoC и glpK оказывается эпистатическим с комбинированными мутациями, приводящими к большему увеличению скорости роста, чем сумма эффекта обеих мутаций по отдельности.

Полиомные данные показали, что две мутации в штамме DKI проявляют эпистаз, наблюдаемый на метаболическом уровне. Снижение уровней транспортеров, цикла TCA и глиоксилатных ферментов может быть связано с мутацией glpK , тогда как снижение уровня связанных со стрессом ферментов и ферментов кислотной устойчивости запускается мутацией rpoC (дополнительный рис.6). Более того, профили метаболитов и протеомов штамма DKI также обладают уникальными свойствами, отличными от штаммов GLPK и RPOC. Примечательно, что секреция лактата особенно повышена (> 19 раз по сравнению с WT) у штамма DKI и наиболее очевидна на более поздней фазе роста (рис. 3d). Это уникальное метаболическое изменение демонстрирует синергетический эффект мутаций rpoC и glpK , при этом высокое соотношение NADH / NAD ⁺ в штамме RPOC, по-видимому, способствует превращению пирувата в лактат (двукратное увеличение секреции лактата), в то время как высокое соотношение поток углерода, индуцированный мутацией glpK , увеличивал его секрецию в четыре раза (рис. 2c и 3b и дополнительный рис.5). Повышенная продукция лактата может регенерировать NAD ⁺ из NADH (таким образом, более низкое соотношение NADH / NAD ⁺ на фиг. 2c) для поддержки высокой гликолитической активности и более быстрого роста штамма DKI. Кроме того, некоторые другие метаболиты также, по-видимому, специфически секретируются на более высоких уровнях штаммом DKI (дополнительный рис. 8).

В штамме RPOC клеточный уровень путресцина (полиамина) был увеличен в пять раз по сравнению с WT ( t -тест, скорректированный Бонферрони P <0.01, n = 6, рис. 2а). В E. coli этот полиамин необходим для пролиферации клеток и нормального роста клеток ³⁵ , но также было показано, что он оказывает отрицательное влияние на рост клеток при высокой концентрации ³⁶ . Ранее сообщалось, что путресцин стимулирует выработку аденилатциклазы и RpoS ^19,20 . Эта активация согласуется с текущими данными, согласно которым как цАМФ (рис. 2а), так и RpoS (дополнительный рис. 4) также были увеличены в штамме RPOC.С дополнительной мутацией в гене glpK концентрация путресцина в штамме DKI была снижена до уровня, сравнимого с WT ( t -тест, с поправкой Бонферрони P > 0,05, n = 6), и это было сопровождается уменьшением цАМФ (рис. 3c) и RpoS (рис. 3d и дополнительный рис. 6). Следовательно, взаимодействие между мутациями rpoC и glpK и путресциновым путем и, следовательно, с многочисленными генами, регулируемыми цАМФ и RpoS, также может способствовать усилению роста клеток в штамме DKI.

Эпистатическое взаимодействие между мутациями glpK и rpoC также очевидно в пиримидиновом пути. С единственной мутацией в гене rpoC штамм RPOC снижает потерю углерода в форме карбамоиласпартата, оротата и дигидрооротата (рис. 2e). Изменения отражаются в штамме DKI еще большим снижением внеклеточной концентрации этих метаболитов, а также внутриклеточных ферментов пиримидинового пути (рис. 2e и дополнительный рис.6), показывая, что механизм сохранения углерода, инициированный мутацией rpoC , дополнительно усиливается мутацией glpK в штамме DKI. Вместе эти особенности штамма DKI поддерживают и предоставляют специфические молекулярные детали для эпистатического эффекта адаптивных мутаций, приводящего к усилению роста клеток по сравнению с комбинированным эффектом отдельных мутаций rpoC и glpK .

Как отмечалось ранее, мутация glpK является специализированной мутацией, улучшающей рост исключительно глицерина, в то время как мутация rpoC является универсальной, улучшающей рост нескольких источников углерода ^10,11 .Наше исследование обеспечивает четкую механистическую поддержку в виде общей экономии энергии и эффективной реорганизации метаболизма с помощью мутации rpoC , которая может улучшить рост большинства источников углерода (на минимальной среде), в то время как эффекты мутации glpK , очевидно, зависят от глицерина. Мутация rpoC улучшила метаболическую эффективность и выход биомассы, в то время как быстрое использование глицерина после мутации glpK приводит к более быстрой, но более расточительной метаболической функции.Вместе DKI сочетает в себе высокий выход биомассы и метаболическую эффективность с быстрым потоком углерода и, следовательно, производством лактата, чтобы доминировать в ландшафте адаптивной эволюции глицерина.

Хотя мы не можем делать прямых заявлений об универсальности наших результатов (на основе характеристики одной пары мутантов rpoC / glpK ) относительно других мутаций в rpoC и glpK , которые возникают в процессе эволюции. , есть веские основания полагать, что результаты имеют большую актуальность.Во-первых, было обнаружено, что несколько различных мутаций rpoC генерируют хорошо законсервированные изменения транскриптома ¹¹ . Кроме того, влияние на путь биосинтеза пиримидина, по-видимому, связано с мутациями в rph — pyrE , которые также способствуют увеличению скорости роста в сочетании с другими мутациями ⁸ .

Добавить комментарий Отменить ответ

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Комментарий *

Имя *

Email *

Сайт